Mitochondrial energy conversion requires an intricate architecture of the inner mitochondrial membrane 1 . Here we show that in ciliates, the membrane curvature is provided by a supercomplex containing all four respiratory chain components. We report cryo-electron microscopy and cryo-tomography structures of the supercomplex that comprises 150 different proteins and 311 bound lipids, forming a stable 5.8-megadalton assembly. Due to subunit acquisition and extension, complex I associates with a complex IV dimer, generating a wedge-shaped gap that serves as a binding site for complex II. Together with a tilted complex III dimer association, it results in a curved membrane region. Using molecular dynamics simulations, we demonstrate that the divergent supercomplex actively contributes to the membrane curvature induction and cristae tubulation. Our findings explain how the architecture of the native I-II-III 2 -IV 2 supercomplex reflects the functional specialization of bioenergetics by shaping the membrane.

Abstract The mitochondrial genome encodes core subunits involved in the process of oxidative phosphorylation. The sequence and structure of these mitochondria-encoded polypeptides are expected to be shaped by bioenergetic requirements linked to diet and environment. Here, we have developed a robust and effective method for highlighting phylogenetic tree edges with unexpectedly rapid, and likely consequential, substitutions within mitochondrial proteins. Further, our approach allows detection of discrete protein substitutions likely to alter enzyme performance. A survey of mammalian taxonomic groups performed using our method indicates that widely conserved residues in mitochondria-encoded proteins are more likely to rapidly mutate toward variants providing lower OXPHOS activity within specific clades. Intriguingly, our data suggest reduced cellular metabolism of ancestral anthropoids, and our findings have potential implications regarding primate encephalization. Significance Statement Mitochondria harbor DNA (mtDNA) that encodes proteins important for converting food into energy. The environment and lifestyle of an organism shapes, and is shaped by, the sequences of these mitochondrial genomes. We developed a new approach for the detection of rapid functional change to proteins, and we applied our method to the mitochondria-encoded polypeptides of mammals. We found that primates displayed a general signature of relative hypometabolism that is shared with other mammals characterized by a low metabolic rate. Indications of reduced cellular metabolism extend even to the earliest anthropoids. Our findings have potential implications regarding the evolution of an enlarged primate brain.

Abstract Multiple resistance and pH adaptation (Mrp) cation/proton antiporters are essential for growth of a variety of halophilic and alkaliphilic bacteria under stress conditions. Mrp-type antiporters are closely related to the membrane domain of respiratory complex I. We determined the structure of the Mrp antiporter from Bacillus pseudofirmus by electron cryo-microscopy at 2.2 Å resolution. The structure resolves more than 99% of the sidechains of the seven membrane subunits MrpA to MrpG plus 360 water molecules, including ∼70 in putative ion translocation pathways. Molecular dynamics simulations based on the high-resolution structure revealed details of the antiport mechanism. We find that switching the position of a histidine residue between three hydrated pathways in the MrpA subunit is critical for proton transfer that drives gated transmembrane sodium translocation. Several lines of evidence indicate that the same histidine-switch mechanism operates in respiratory complex I.

Abstract Respiratory complex I in mitochondria and bacteria catalyzes the transfer of electrons from NADH to quinone (Q). The free energy available from the reaction is used to pump protons and to establish a membrane proton electrochemical gradient, which drives ATP synthesis. Even though several high-resolution structures of complex I have been resolved, how Q reduction is linked with proton pumping, remains unknown. Here, microsecond long molecular dynamics (MD) simulations were performed on Yarrowia lipolytica complex I structures where Q molecules have been resolved in the ~30 Å long Q tunnel. MD simulations of several different redox/protonation states of Q reveal the coupling between the Q dynamics and the restructuring of conserved loops and ion pairs. Oxidized quinone stabilizes towards the N2 FeS cluster, a binding mode not previously described in Yarrowia lipolytica complex I structures. On the other hand, reduced (and protonated) species tend to diffuse towards the Q binding sites closer to the tunnel entrance. Mechanistic and physiological relevance of these results are discussed.

Abstract In response to the ongoing SARS-CoV-2 pandemic, the quest for coronavirus inhibitors has inspired research on a variety of small proteins beyond conventional antibodies, including robust single-domain antibody fragments, ‘nanobodies’. Here, we explore the potential of nanobody engineering in the development of antivirals and diagnostic tools. Through fusion of nanobody domains that target distinct binding sites, we engineered multimodular nanobody constructs that neutralize wild-type SARS-CoV-2 and the Alpha and Delta variants with high potency, with IC50 values up to 50 pM. However, we observed a limitation in the efficacy of multimodular nanobodies against the Beta (B.1.351) and Omicron variants (B.1.1.529), underlining the importance of accounting for viral evolution in the design of biologics. To further explore the applications of nanobody engineering in outbreak management, we present a novel detection assay, based on fusions of nanobodies with fragments of NanoLuc luciferase that can detect sub-nanomolar quantities of the SARS-CoV-2 spike protein in a single step. Our work showcases the potential of nanobody engineering to combat emerging infectious disease.

Abstract In response to cold, mammals activate brown fat for respiratory-dependent thermogenesis reliant on the electron transport chain (1, 2). Yet, the structural basis of respiratory complex adaptation to cold remains elusive. Herein we combined thermoregulatory physiology and cryo-EM to study endogenous respiratory supercomplexes exposed to different temperatures. A cold-induced conformation of CI:III 2 (termed type 2) was identified with a ∼25° rotation of CIII 2 around its inter-dimer axis, shortening inter-complex Q exchange space, and exhibiting different catalytic states which favor electron transfer. Large-scale supercomplex simulations in lipid membrane reveal how unique lipid-protein arrangements stabilize type 2 complexes to enhance catalytic activity. Together, our cryo-EM studies, multiscale simulations and biochemical analyses unveil the mechanisms and dynamics of respiratory adaptation at the structural and energetic level.

Summary Mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) is a 1 MDa membrane protein complex with a central role in energy metabolism. Redox-driven proton translocation by complex I contributes substantially to the proton motive force that drives ATP synthase. Several structures of complex I from bacteria and mitochondria have been determined but its catalytic mechanism has remained controversial. We here present the cryo-EM structure of complex I from Yarrowia lipolytica at 2.1 Å resolution, which reveals the positions of more than 1600 protein-bound water molecules, of which ∼100 are located in putative proton translocation pathways. Another structure of the same complex under steady-state activity conditions at 3.4 Å resolution indicates conformational transitions that we associate with proton injection into the central hydrophilic axis. By combining high-resolution structural data with site-directed mutagenesis and large-scale molecular dynamics simulations, we define details of the proton translocation pathways, and offer new insights into the redox-coupled proton pumping mechanism of complex I.

The charge states of titratable amino acid residues play a key role in the function of membrane-bound bioenergetic proteins. However, determination of these charge states both through experimental and computational approaches is extremely challenging. Cryo-EM density maps can provide insights on the charge states of titratable amino acid residues. By performing classical atomistic molecular dynamics simulations on the high resolution cryo-EM structures of respiratory complex I from Yarrowia lipolytica, we analyze the conformational and charge states of a key acidic residue in its ND1 subunit, aspartic acid D203, which is also a mitochondrial disease mutation locus. We suggest that in the native state of respiratory complex I, D203 is negatively charged and maintains a stable hydrogen bond to a conserved arginine residue. Alternatively, upon conformational change in the turnover state of the enzyme, its sidechain attains a charge-neutral status. We discuss the implications of this analysis on the molecular mechanism of respiratory complex I.

Abstract Classical molecular dynamics (MD) simulations provide unmatched spatial and time resolution of protein structure and function. However, accuracy of MD simulations often depends on the quality of force field parameters and the time scale of sampling. Another limitation of conventional MD simulations is that the protonation states of titratable amino acid residues remain fixed during simulations, even though protonation state changes coupled to conformational dynamics are central to protein function. Due to the uncertainty in selecting protonation states, classical MD simulations are sometimes performed with all amino acids modeled in their standard charged states at pH 7. Here we performed and analyzed classical MD simulations on high-resolution cryo-EM structures of two membrane proteins that transfer protons by catalyzing protonation/deprotonation reactions. In simulations performed with amino acids modeled in their standard protonation state the structure diverges far from its starting conformation. In comparison, MD simulations performed with pre-determined protonation states of amino acid residues reproduce the structural conformation, protein hydration, and protein-water and protein-protein interactions of the structure much better. The results suggest it is crucial to perform basic protonation state calculations, especially on structures where protonation changes play an important functional role, prior to launching any MD simulations. Furthermore, the combined approach of protonation state prediction and MD simulations can provide valuable information on the charge states of amino acids in the cryo-EM sample. Even though accurate prediction of protonation states currently remains a challenge, we introduce an approach of combining pKa prediction with cryo-EM density map analysis that helps in improving not only the protonation state predictions, but also the atomic modeling of density data.

Hummingbirds in flight exhibit the highest metabolic rate of all vertebrates. The bioenergetic requirements associated with hovering flight raise the possibility of positive selection upon proteins encoded by hummingbird mitochondrial DNA. Here, we have identified a non-conservative change within the mitochondria-encoded cytochrome c oxidase subunit I (COI) that is fixed within hummingbirds, yet exceedingly rare among other metazoans. This unusual change can also be identified in several nectarivorous hovering insects, hinting at convergent evolution linked to diet or mode of flight over ~800 million years. We performed atomistic molecular dynamics simulations using bovine and hummingbird COI models, thereby bypassing experimental limitations imposed by the inability to modify mtDNA in a site-specific manner. Intriguingly, our findings suggest that COI amino acid position 153 provides control over the hydration and activity of a key proton channel. We discuss potential phenotypic outcomes for the hummingbird that are linked to this intriguing instance of positive selection upon the mitochondrial genome.SIGNIFICANCE STATEMENT How do organisms adapt to niches and environments that require unusual metabolic features? Changes to mitochondrial function are expected to be tightly linked to bioenergetic adaptation. Several proteins required for converting food into energy useful for the cell are specifically encoded by the mitochondrial genome, suggesting that adaptations required for exceptional metabolic performance might be found at this location. Here, we find that all hummingbirds harbor a remarkable change within their mitochondrial DNA that appears to be required for outstanding metabolic properties of this organism. Further analysis by computational simulations suggests that this hummingbird substitution alters proton movement across the mitochondrial inner membrane.