Using next-generation sequencing technology alone, we have successfully generated and assembled a draft sequence of the giant panda genome. The assembled contigs (2.25 gigabases (Gb)) cover approximately 94% of the whole genome, and the remaining gaps (0.05 Gb) seem to contain carnivore-specific repeats and tandem repeats. Comparisons with the dog and human showed that the panda genome has a lower divergence rate. The assessment of panda genes potentially underlying some of its unique traits indicated that its bamboo diet might be more dependent on its gut microbiome than its own genetic composition. We also identified more than 2.7 million heterozygous single nucleotide polymorphisms in the diploid genome. Our data and analyses provide a foundation for promoting mammalian genetic research, and demonstrate the feasibility for using next-generation sequencing technologies for accurate, cost-effective and rapid de novo assembly of large eukaryotic genomes. The genome of the giant panda — specifically of the female Beijing Olympics mascot Jingjing — has been determined using short-read sequencing technology, a first for such a complex genome. It consists of some 2.4 billion DNA base pairs, compared to 3 billion in humans, and contains around 21,000 protein-encoding genes, similar to the human genome. Genomic diversity reflected in the sequence is high, raising hopes that despite a population of only about 2,500, conservation efforts can keep the species from extinction. Intriguingly, the panda appears to have all the genes needed for a carnivorous digestive system but lacks digestive cellulase genes. It may therefore depend on its gut microbiome to handle its famously limited bamboo diet. Taste may be a diet-limiting factor: loss of function of the T1R1 gene means that pandas may not experience the umami taste associated with high-protein foods. Technical aspects of this work pave the way for the use of next-generation sequencing for rapid de novo assembly of large eukaryotic genomes. Here, a draft sequence of the giant panda genome is assembled using next-generation sequencing technology alone. Genome analysis reveals a low divergence rate in comparison with dog and human genomes and insights into panda-specific traits; for example, the giant panda's bamboo diet may be more dependent on its gut microbiome than its own genetic composition.

N6-methyladenosine (m6A) is an abundant internal modification of messenger RNA (mRNA) that has been reported recently in thousands of mammalian mRNAs and long non-coding RNAs (lncRNAs). Zhao and colleagues identify two methyltransferases responsible for this modification in mammalian cells, and demonstrate that they are required for embryonic stem cell self-renewal maintenance through an effect of the modification on the degradation of developmental regulator transcripts. N6-methyladenosine (m6A) has been identified as the most abundant internal modification of messenger RNA in eukaryotes1. m6A modification is involved in cell fate determination in yeast2,3 and embryo development in plants4,5. Its mammalian function remains unknown but thousands of mammalian mRNAs and long non-coding RNAs (lncRNAs) show m6A modification6,7 and m6A demethylases are required for mammalian energy homeostasis and fertility8,9. We identify two proteins, the putative m6A MTase, methyltransferase-like 3 (Mettl3; ref. 10), and a related but uncharacterized protein Mettl14, that function synergistically to control m6A formation in mammalian cells. Knockdown of Mettl3 and Mettl14 in mouse embryonic stem cells (mESCs) led to similar phenotypes, characterized by lack of m6A RNA methylation and lost self-renewal capability. A large number of transcripts, including many encoding developmental regulators, exhibit m6A methylation inversely correlated with mRNA stability and gene expression. The human antigen R (HuR) and microRNA pathways were linked to these effects. This gene regulatory mechanism operating in mESCs through m6A methylation is required to keep mESCs at their ground state and may be relevant to thousands of mRNAs and lncRNAs in various cell types.

Essential genes have been effectively studied using temperature-sensitive alleles in yeast. Li et al. construct a large collection of temperature-sensitive yeast mutants and show how it enables high-throughput analyses of the function of essential genes. Conditional temperature-sensitive (ts) mutations are valuable reagents for studying essential genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We constructed 787 ts strains, covering 497 (∼45%) of the 1,101 essential yeast genes, with ∼30% of the genes represented by multiple alleles. All of the alleles are integrated into their native genomic locus in the S288C common reference strain and are linked to a kanMX selectable marker, allowing further genetic manipulation by synthetic genetic array (SGA)–based, high-throughput methods. We show two such manipulations: barcoding of 440 strains, which enables chemical-genetic suppression analysis, and the construction of arrays of strains carrying different fluorescent markers of subcellular structure, which enables quantitative analysis of phenotypes using high-content screening. Quantitative analysis of a GFP-tubulin marker identified roles for cohesin and condensin genes in spindle disassembly. This mutant collection should facilitate a wide range of systematic studies aimed at understanding the functions of essential genes.

Internal N

Abstract N6-methyladenosine (m6A), the most abundant internal modification on eukaryotic mRNA, and N6, 2′-O-dimethyladenosine (m6Am), are epitranscriptomic marks that function in multiple aspects of posttranscriptional regulation. Fat mass and obesity-associated protein (FTO) can remove both m 6 A and m6Am; however, little is known about how FTO achieves its substrate selectivity. Here, we demonstrate that ZBTB48, a C2H2-zinc finger protein that functions in telomere maintenance, associates with FTO and binds both mRNA and the telomere-associated regulatory RNA TERRA to regulate the functional interactions of FTO with target transcripts. Specifically, depletion of ZBTB48 affects targeting of FTO to sites of m6A/m6Am modification, changes cellular m6A/m6Am levels and, consequently, alters decay rates of target RNAs. ZBTB48 ablation also accelerates growth of HCT-116 colorectal cancer cells and modulates FTO- dependent regulation of Metastasis-associated protein 1 (MTA1) transcripts by controlling the binding to MTA1 mRNA of the m6A reader IGF2BP2. Our findings thus uncover a previously unknown mechanism of posttranscriptional regulation in which ZBTB48 co-ordinates RNA- binding of the m6A/m6Am demethylase FTO to control expression of its target RNAs.

Abstract Retinoblastoma-binding proteins 4 and 7 (RBBP4 and RBBP7) are two highly homologous human histone chaperones. They function in epigenetic regulation as subunits of multiple chromatin-related complexes and have been implicated in numerous cancers. Due to their overlapping functions, our understanding of RBBP4 and 7, particularly outside of Opisthokonts, has remained limited. Here, we report that in the ciliate protozoan Tetrahymena thermophila a single orthologue of human RBBP4 and 7 proteins, RebL1, physically interacts with histone H4 and functions in multiple epigenetic regulatory pathways. Functional proteomics identified conserved functional links associated with Tetrahymena RebL1 protein as well as human RBBP4 and 7. We found that putative subunits of multiple chromatin-related complexes including CAF1, Hat1, Rpd3, and MuvB, co-purified with RebL1 during Tetrahymena growth and conjugation. Iterative proteomics analyses revealed that the cell cycle regulatory MuvB-complex in Tetrahymena is composed of at least five subunits including evolutionarily conserved Lin54, Lin9 and RebL1 proteins. Genome-wide analyses indicated that RebL1 and Lin54 (Anqa1) bind within genic and intergenic regions. Moreover, Anqa1 targets primarily promoter regions suggesting a role for Tetrahymena MuvB in transcription regulation. RebL1 depletion decreased cellular viability and altered the expression of selected targets. Consistent with observations in glioblastoma tumors, RebL1 depletion suppressed DNA repair protein Rad51 in Tetrahymena , thus underscoring the evolutionarily conserved functions of RBBP4/7 proteins. Our results suggest the essentiality of RebL1 functions in multiple epigenetic regulatory complexes in which it impacts transcription regulation and cellular viability.

ABSTRACT The pituitary gland regulates essential physiological processes such as growth, pubertal onset, stress response, metabolism, reproduction, and lactation. While sex biases in these functions and hormone production have been described, the underlying identity, temporal deployment, and cell-type specificity of sex-biased pituitary gene regulatory networks are not fully understood. To capture sex differences in pituitary gene regulation dynamics during postnatal development, we performed 3’ untranslated region sequencing and small RNA sequencing to ascertain gene and microRNA expression respectively across five postnatal ages (postnatal days 12, 22, 27, 32, 37) that span the pubertal transition in female and male C57BL/6J mouse pituitaries (n=5-6 biological replicates for each sex at each age). We observed over 900 instances of sex-biased gene expression and 17 sex-biased microRNAs, with the majority of sex differences occurring with puberty. Using miRNA-gene target interaction databases, we identified 18 sex-biased genes that were putative targets of 5 sex-biased microRNAs. In addition, by combining our bulk RNA-seq with publicly available male and female mouse pituitary single-nuclei RNA-seq data, we obtained evidence that cell-type proportion sex differences exist prior to puberty and persist post-puberty for three major hormone-producing cell types: somatotropes, lactotropes, and gonadotropes. Finally, we predicted sex-biased genes in these three pituitary cell types after accounting for cell-type proportion differences between sexes. Our study reveals the identity and postnatal developmental trajectory of sex-biased gene expression in the mouse pituitary. This work also highlights the importance of considering sex biases in cell-type composition when understanding sex differences in the processes regulated by the pituitary gland. Highlights Male and female mouse pituitary gland gene and miRNA expression was profiled across five postnatal ages spanning pubertal development Abundant sex differences in pituitary gene expression exist prior to puberty and become more prominent upon puberty Combining expression data from genes and miRNAs revealed 18 putative sex-biased gene targets of 5 sex-biased miRNAs Sex differences in the proportions of somatotropes, lactotropes, and gonadotropes are predicted to occur prior to puberty

Abstract Recent advances in spatial transcriptomics have enabled simultaneous preservation of high‐throughput gene expression profiles and the spatial context, enabling high‐resolution exploration of distinct regional characterization in tissue. To effectively understand the underlying biological mechanisms within tissue microenvironments, there is a requisite for methods that can accurately capture external spatial heterogeneity and interpret internal gene regulation from spatial transcriptomics data. However, current methods for region identification often lack the simultaneous characterizing of spatial structure and gene regulation, thereby limiting the ability of spatial dissection and gene interpretation. Here, stDCL is developed, a dual graph contrastive learning method to identify spatial domains and interpret gene regulation in spatial transcriptomics data. stDCL adaptively incorporates gene expression data and spatial information via a graph embedding autoencoder, thereby preserving critical information within the latent embedding representations. In addition, dual graph contrastive learning is proposed to train the model, ensuring that the latent embedding representation closely resembles the actual spatial distribution and exhibits cluster similarity. Benchmarking stDCL against other state‐of‐the‐art clustering methods using complex cortex datasets demonstrates its superior accuracy and effectiveness in identifying spatial domains. Our analysis of the imputation matrices generated by stDCL reveals its capability to reconstruct spatial hierarchical structures and refine differential expression assessment. Furthermore, it is demonstrated that the versatility of stDCL in interpretability of gene regulation, spatial heterogeneity at high resolution, and embryonic developmental patterns. In addition, it is also showed that stDCL can successfully annotate disease‐associated astrocyte subtypes in Alzheimer's disease and unravel multiple relevant pathways and regulatory mechanisms.

Abstract The COVID-19 pandemic has caused over one million deaths thus far. There is an urgent need for the development of specific viral therapeutics and a vaccine. SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) protein is highly expressed upon infection and is essential for viral replication, making it a promising target for both antiviral drug and vaccine development. Here, starting from a functional proteomics workflow, we initially catalogued the protein-protein interactions of 21 SARS-CoV-2 proteins in HEK293 cells, finding that the stress granule resident proteins G3BP1 and G3BP2 copurify with N with high specificity. We demonstrate that N protein expression in human cells sequesters G3BP1 and G3BP2 through its physical interaction with these proteins, attenuating stress granule (SG) formation. The ectopic expression of G3BP1 in N-expressing cells was sufficient to reverse this phenotype. Since N is an RNA-binding protein, we performed iCLIP-sequencing experiments in cells, with or without exposure to oxidative stress, to identify the host RNAs targeted by N. Our results indicate that SARS-CoV-2 N protein binds directly to thousands of mRNAs under both conditions. Like the G3BPs stress granule proteins, N was found to predominantly bind its target mRNAs in their 3’UTRs. RNA sequencing experiments indicated that expression of N results in wide-spread gene expression changes in both unstressed and oxidatively stressed cells. We suggest that N regulates host gene expression by both attenuating stress granules and binding directly to target mRNAs.