Abstract Clostridioides difficile is the major worldwide cause of antibiotic-associated gastrointestinal infection. A pathogenicity locus (PaLoc) encoding one or two homologous toxins, toxin A (TcdA) and toxin B (TcdB) is essential for C. difficile pathogenicity. However, toxin sequence variation poses major challenges for the development of diagnostic assays, therapeutics, and vaccines. Here, we present a comprehensive phylogenomic analysis 8,839 C. difficile strains and their toxins including 6,492 genomes that we assembled from the NCBI short read archive. A total of 5,175 tcdA and 8,022 tcdB genes clustered into 7 (A1-A7) and 12 (B1-B12) distinct subtypes, which form the basis of a new method for toxin-based subtyping of C. difficile . We developed a haplotype coloring algorithm to visualize amino acid variation across all toxin sequences, which revealed that TcdB has diversified through extensive homologous recombination throughout its entire sequence, and formed new subtypes through distinct recombination events. In contrast, TcdA varies mainly in the number of repeats in its C-terminal repetitive region, suggesting that recombination-mediated diversification of TcdB provides a selective advantage in C. difficile evolution. The application of toxin subtyping is then validated by classifying 351 C. difficile clinical isolates from Brigham and Women’s Hospital in Boston, demonstrating its clinical utility. Subtyping partitions TcdB into binary functional and antigenic groups generated by intragenic recombinations, including two distinct cell-rounding phenotypes, whether recognizing frizzled proteins as receptors, and whether it can be efficiently neutralized by monoclonal antibody bezlotoxumab, the only FDA-approved therapeutic antibody. Our analysis also identifies eight universally conserved surface patches across the TcdB structure, representing ideal targets for developing broad-spectrum therapeutics. Finally, we established an open online database (DiffBase) as a central hub for collection and classification of C. difficile toxins, which will help clinicians decide on therapeutic strategies targeting specific toxin variants, and allow researchers to monitor the ongoing evolution and diversification of C. difficile .

Abstract The analysis and comparison of gene neighborhoods is a powerful approach for exploring microbial genome structure, function, and evolution. Although numerous tools exist for genome visualization and comparison, genome exploration across large genomic databases or user-generated datasets remains a challenge. Here, we introduce AnnoView, a web server designed for interactive exploration of gene neighborhoods across the bacterial and archaeal tree of life. Our server offers users the ability to identify, compare, and visualize gene neighborhoods of interest from 30,238 bacterial genomes and 1,672 archaeal genomes, through integration with the comprehensive GTDB and AnnoTree databases. Identified gene neighborhoods can be visualized using pre-computed functional annotations from different sources such as KEGG, Pfam, and TIGRFAM, or clustered based on similarity. Alternatively, users can upload and explore their own custom genomic datasets in GBK, GFF, or CSV format, or use AnnoView as a genome browser for relatively small genomes (e.g., viruses and plasmids). Ultimately, we anticipate that AnnoView will catalyze biological discovery by enabling user-friendly search, comparison, and visualization of genomic data. AnnoView is available at http://annoview.uwaterloo.ca

Abstract Botulinum neurotoxins (BoNTs) are the most potent family of toxins known to science. Bioinformatic studies in recent years have revealed that they are members of a broader toxin family, with an increasing number of divergent homologs identified in genomes of organisms outside of the Clostridium genus. Here, we report the identification of two putative divergent BoNT-like homologs in the genomes of two strains of Paeniclostridium ghonii . We designated them PG-toxin 1 (PGT1) and PG-toxin 2 (PGT2), which share ~54% protein sequence identity. Unlike any other known BoNT homologs, PGT1 and PGT2 are composed of two separate subunits encoded on two neighboring genes: one encoding the protease domain (light chain, LC) with a conserved HExxH motif, and the second encoding the heavy-chain (HC) containing the putative translocation domain and receptor-binding domain. Phylogenetic analysis of both the LC and HC reveal that it is a divergent member of the lineage of BoNT that also includes BoNT/X, BoNT/En and the insecticidal PMP1. The gene clusters harboring PGT1 and PGT2 also include a putative insecticidal delta-endotoxin, Cry8Ea1, as well as putative endolysin and bacteriocin genes that may facilitate lytic toxin secretion, suggesting a possibility that this gene cluster might serve an insecticidal purpose.

SUMMARY The analysis of microbial genomes from human archaeological samples offers a historic snapshot of ancient pathogens and provides insights into the origins of modern infectious diseases. Here, through a large-scale metagenomic analysis of archeological samples, we discovered bacterial species related to modern-day Clostridium tetani , which produces the tetanus neurotoxin (TeNT) and causes the disease tetanus. We assembled draft genomes from 38 distinct human archeological samples spanning five continents and dating to as early as ~4000 BCE. These genomes had varying levels of completeness and a subset of them displayed hallmarks of ancient DNA damage. While 24 fall into known C. tetani clades, phylogenetic analysis revealed novel C. tetani lineages, as well as two novel Clostridium species (“ Clostridium sp. X and Y”) closely related to C. tetani . Within these genomes, we found 13 TeNT variants with unique substitution profiles, including a subgroup of TeNT variants found exclusively in ancient samples from South America. We experimentally tested a TeNT variant selected from a ~6000-year-old Chilean mummy sample and found that it induced tetanus muscle paralysis in mice with potency comparable to modern TeNT. Our work identifies neurotoxigenic C. tetani in ancient DNA, new Clostridium species unique to ancient human samples, and a novel variant of TeNT that can cause disease in mammals.