The transthyretin amyloidoses (ATTR) are invariably fatal diseases characterized by progressive neuropathy and/or cardiomyopathy. ATTR are caused by aggregation of transthyretin (TTR), a natively tetrameric protein involved in the transport of thyroxine and the vitamin A–retinol-binding protein complex. Mutations within TTR that cause autosomal dominant forms of disease facilitate tetramer dissociation, monomer misfolding, and aggregation, although wild-type TTR can also form amyloid fibrils in elderly patients. Because tetramer dissociation is the rate-limiting step in TTR amyloidogenesis, targeted therapies have focused on small molecules that kinetically stabilize the tetramer, inhibiting TTR amyloid fibril formation. One such compound, tafamidis meglumine (Fx-1006A), has recently completed Phase II/III trials for the treatment of Transthyretin Type Familial Amyloid Polyneuropathy (TTR-FAP) and demonstrated a slowing of disease progression in patients heterozygous for the V30M TTR mutation. Herein we describe the molecular and structural basis of TTR tetramer stabilization by tafamidis. Tafamidis binds selectively and with negative cooperativity (K d s ∼2 nM and ∼200 nM) to the two normally unoccupied thyroxine-binding sites of the tetramer, and kinetically stabilizes TTR. Patient-derived amyloidogenic variants of TTR, including kinetically and thermodynamically less stable mutants, are also stabilized by tafamidis binding. The crystal structure of tafamidis-bound TTR suggests that binding stabilizes the weaker dimer-dimer interface against dissociation, the rate-limiting step of amyloidogenesis.

Significance Communication between nerve cells occurs at specialized cellular structures known as synapses. Loss of synaptic function is associated with cognitive decline in Alzheimer’s disease (AD). However, the mechanism of synaptic damage remains incompletely understood. Here we describe a pathway for synaptic damage whereby amyloid-β 1–42 peptide (Aβ 1–42 ) releases, via stimulation of α7 nicotinic receptors, excessive amounts of glutamate from astrocytes, in turn activating extrasynaptic NMDA-type glutamate receptors (eNMDARs) to mediate synaptic damage. The Food and Drug Administration-approved drug memantine offers some beneficial effect, but the improved eNMDAR antagonist NitroMemantine completely ameliorates Aβ-induced synaptic loss, providing hope for disease-modifying intervention in AD.

Genetic evidence suggests that inhibition of amyloid fibril formation by small molecules should be effective against amyloid diseases. Known amyloid inhibitors appear to function by shifting the aggregation equilibrium away from the amyloid state. Here, we describe a series of transthyretin amyloidosis inhibitors that functioned by increasing the kinetic barrier associated with misfolding, preventing amyloidogenesis by stabilizing the native state. The trans-suppressor mutation, threonine 119 → methionine 119, which is known to ameliorate familial amyloid disease, also functioned through kinetic stabilization, implying that this small-molecule strategy should be effective in treating amyloid diseases.

Amyloid-β amyloidogenesis is reported to occur via a nucleated polymerization mechanism. If this is true, the energetically unfavorable oligomeric nucleus should be very hard to detect. However, many laboratories have detected early nonfibrillar amyloid-β oligomers without observing amyloid fibrils, suggesting that a mechanistic revision may be needed. Here we introduce Cys-Cys-amyloid-β(1-40), which cannot bind to the latent fluorophore FlAsH as a monomer, but can bind FlAsH as an nonfibrillar oligomer or as a fibril, rendering the conjugates fluorescent. Through FlAsH monitoring of Cys-Cys-amyloid-β(1-40) aggregation, we found that amyloid-β(1-40) rapidly and efficiently forms spherical oligomers in vitro (85% yield) that are kinetically competent to slowly convert to amyloid fibrils by a nucleated conformational conversion mechanism. This methodology was used to show that plasmalogen ethanolamine vesicles eliminate the proteotoxicity-associated oligomerization phase of amyloid-β amyloidogenesis while allowing fibril formation, rationalizing how low concentrations of plasmalogen ethanolamine in the brain are epidemiologically linked to Alzheimer's disease.

Drug candidates are generally discovered using biochemical screens employing an isolated target protein or by utilizing cell-based phenotypic assays. Both noncovalent and covalent hits emerge from such endeavors. Herein, we exemplify an "Inverse Drug Discovery" strategy in which organic compounds of intermediate complexity harboring weak, but activatable, electrophiles are matched with the protein(s) they react with in cells or cell lysate. An alkyne substructure in each candidate small molecule enables affinity chromatography–mass spectrometry, which produces a list of proteins that each distinct compound reacts with. A notable feature of this approach is that it is agnostic with respect to the cellular proteins targeted. To illustrate this strategy, we employed aryl fluorosulfates, an underexplored class of sulfur(VI) halides, that are generally unreactive unless activated by protein binding. Reversible aryl fluorosulfate binding, correct juxtaposition of protein side chain functional groups, and transition-state stabilization of the S(VI) exchange reaction all seem to be critical for conjugate formation. The aryl fluorosulfates studied thus far exhibit chemoselective reactivity toward Lys and, particularly, Tyr side chains, and can be used to target nonenzymes (e.g., a hormone carrier or a small-molecule carrier protein) as well as enzymes. The "Inverse Drug Discovery" strategy should be particularly attractive as a means to explore latent electrophiles not typically used in medicinal chemistry efforts, until one reacts with a protein target of exceptional interest. Structure–activity data can then be used to enhance the selectivity of conjugate formation or the covalent probe can be used as a competitor to develop noncovalent drug candidates. Here we use the "Inverse Drug Discovery" platform to identify and validate covalent ligands for 11 different human proteins. In the case of one of these proteins, we have identified and validated a small-molecule probe for the first time.

Arylfluorosulfates have appeared only rarely in the literature and have not been explored as probes for covalent conjugation to proteins, possibly because they were assumed to possess high reactivity, as with other sulfur(VI) halides. However, we find that arylfluorosulfates become reactive only under certain circumstances, e.g., when fluoride displacement by a nucleophile is facilitated. Herein, we explore the reactivity of structurally simple arylfluorosulfates toward the proteome of human cells. We demonstrate that the protein reactivity of arylfluorosulfates is lower than that of the corresponding aryl sulfonyl fluorides, which are better characterized with regard to proteome reactivity. We discovered that simple hydrophobic arylfluorosulfates selectively react with a few members of the intracellular lipid binding protein (iLBP) family. A central function of iLBPs is to deliver small-molecule ligands to nuclear hormone receptors. Arylfluorosulfate probe 1 reacts with a conserved tyrosine residue in the ligand-binding site of a subset of iLBPs. Arylfluorosulfate probes 3 and 4, featuring a biphenyl core, very selectively and efficiently modify cellular retinoic acid binding protein 2 (CRABP2), both in vitro and in living cells. The X-ray crystal structure of the CRABP2–4 conjugate, when considered together with binding site mutagenesis experiments, provides insight into how CRABP2 might activate arylfluorosulfates toward site-specific reaction. Treatment of breast cancer cells with probe 4 attenuates nuclear hormone receptor activity mediated by retinoic acid, an endogenous client lipid of CRABP2. Our findings demonstrate that arylfluorosulfates can selectively target single iLBPs, making them useful for understanding iLBP function.

Imbalances in endoplasmic reticulum (ER) proteostasis are associated with etiologically-diverse degenerative diseases linked to excessive extracellular protein misfolding and aggregation. Reprogramming of the ER proteostasis environment through genetic activation of the Unfolded Protein Response (UPR)-associated transcription factor ATF6 attenuates secretion and extracellular aggregation of amyloidogenic proteins. Here, we employed a screening approach that included complementary arm-specific UPR reporters and medium-throughput transcriptional profiling to identify non-toxic small molecules that phenocopy the ATF6-mediated reprogramming of the ER proteostasis environment. The ER reprogramming afforded by our molecules requires activation of endogenous ATF6 and occurs independent of global ER stress. Furthermore, our molecules phenocopy the ability of genetic ATF6 activation to selectively reduce secretion and extracellular aggregation of amyloidogenic proteins. These results show that small molecule-dependent ER reprogramming, achieved through preferential activation of the ATF6 transcriptional program, is a promising strategy to ameliorate imbalances in ER function associated with degenerative protein aggregation diseases.

Abstract The condition of having a healthy, functional proteome is known as protein homeostasis, or proteostasis. Establishing and maintaining proteostasis is the province of the proteostasis network, approximately 2,500 genes that regulate protein synthesis, folding, localization, and degradation. The proteostasis network is a fundamental entity in biology with direct relevance to many diseases of protein conformation. However, it is not well defined or annotated, which hinders its functional characterization in health and disease. In this series of manuscripts, we aim to operationally define the human proteostasis network by providing a comprehensive, annotated list of its components. Here, we provide a curated list of 959 unique genes that comprise the protein synthesis machinery, chaperones, folding enzymes, systems for trafficking proteins into and out of organelles, and organelle-specific degradation systems. In subsequent manuscripts, we will delineate the human autophagy-lysosome pathway, the ubiquitin-proteasome system, and the proteostasis networks of model organisms.

The condition of having a healthy, functional proteome is known as protein homeostasis, or proteostasis. Establishing and maintaining proteostasis is the province of the proteostasis network, approximately 2,700 components that regulate protein synthesis, folding, localization, and degradation. The proteostasis network is a fundamental entity in biology that is essential for cellular health and has direct relevance to many diseases of protein conformation. However, it is not well defined or annotated, which hinders its functional characterization in health and disease. In this series of manuscripts, we aim to operationally define the human proteostasis network by providing a comprehensive, annotated list of its components. We provided in a previous manuscript a list of chaperones and folding enzymes as well as the components that make up the machineries for protein synthesis, protein trafficking into and out of organelles, and organelle-specific degradation pathways. Here, we provide a curated list of 838 unique high-confidence components of the autophagy-lysosome pathway, one of the two major protein degradation systems in human cells.