SUMMARY Recent microbial genome sequencing efforts have revealed a vast reservoir of mobile genetic elements containing integrases that could be useful genome engineering tools. Large serine recombinases (LSRs), such as Bxb1 and PhiC31, are bacteriophage-encoded integrases that can facilitate the insertion of phage DNA into bacterial genomes. However, only a few LSRs have been previously characterized and they have limited efficiency in human cells. Here, we developed a systematic computational discovery workflow that identifies thousands of new LSRs and their cognate DNA attachment sites by. We validate this approach via experimental characterization of LSRs in human cells, leading to three classes of LSRs distinguished from one another by their efficiency and specificity. We identify landing pad LSRs that efficiently integrate into synthetically installed attachment sites orthogonal to the human genome, human genome-targeting LSRs with computationally predictable pseudosites, and multi-targeting LSRs that can unidirectionally integrate cargos at with similar efficiency and superior specificity to commonly used transposases. LSRs from each category were functionally characterized in human cells, overall achieving up to 7-fold higher plasmid recombination than Bxb1 and genome insertion efficiencies of 40-70% with cargo sizes over 7 kb. Overall, we establish a paradigm for large-scale discovery of microbial recombinases and reconstruction of their target sites directly from microbial sequencing data. This strategy provides a rich resource of over 60 experimentally characterized LSRs that can function in human cells and thousands of additional candidates for large-payload genome editing without exposed DNA double-stranded breaks.

Genomic rearrangements, encompassing mutational changes in the genome such as insertions, deletions or inversions, are essential for genetic diversity. These rearrangements are typically orchestrated by enzymes that are involved in fundamental DNA repair processes, such as homologous recombination, or in the transposition of foreign genetic material by viruses and mobile genetic elements

Insertion sequence (IS) elements are the simplest autonomous transposable elements found in prokaryotic genomes

Genomic rearrangements, encompassing mutational changes in the genome such as insertions, deletions, or inversions, are essential for genetic diversity. These rearrangements are typically orchestrated by enzymes involved in fundamental DNA repair processes such as homologous recombination or in the transposition of foreign genetic material by viruses and mobile genetic elements (MGEs). We report that IS110 insertion sequences, a family of minimal and autonomous MGEs, express a structured non-coding RNA that binds specifically to their encoded recombinase. This bridge RNA contains two internal loops encoding nucleotide stretches that base-pair with the target DNA and donor DNA, which is the IS110 element itself. We demonstrate that the target-binding and donor-binding loops can be independently reprogrammed to direct sequence-specific recombination between two DNA molecules. This modularity enables DNA insertion into genomic target sites as well as programmable DNA excision and inversion. The IS110 bridge system expands the diversity of nucleic acid-guided systems beyond CRISPR and RNA interference, offering a unified mechanism for the three fundamental DNA rearrangements required for genome design.

Protein-based switches that respond to different inputs to regulate cellular outputs, such as gene expression, are central to synthetic biology. For increased controllability, multi-input switches that integrate several cooperating and competing signals for the regulation of a shared output are of particular interest. The nuclear hormone receptor (NHR) superfamily offers promising starting points for engineering multi-input-controlled responses to clinically approved drugs. Starting from the VgEcR/RXR pair, we demonstrate that novel (multi-)drug regulation can be achieved by exchange of the ecdysone receptor (EcR) ligand binding domain (LBD) for other human NHR-derived LBDs. For responses activated to saturation by an agonist for the first LBD, we show that outputs can be boosted by an agonist targeting the second LBD. In combination with an antagonist, output levels are tunable by up to three simultaneously present small-molecule drugs. Such high-level control validates NHRs as a versatile, engineerable platform for programming multi-drug-controlled responses.