ABSTRACT Understanding how microbial communities maintain stable compositional diversity is key for predicting community function. Studies from species pairwise interactions and synthetic communities indicate that metabolic interactions and spatial organisation can influence coexistence, but the relevance of these factors in more complex communities is unclear. Model systems often lack multi-species complexity, thereby making it difficult to study community diversity temporally. Here we used a spatially-organised cyanobacterial enrichment community to investigate compositional diversity and its stability. Over a year of passaging in media without significant carbon source, we found that the community maintains relatively high diversity, with 17 co-existing bacterial species. Using short and long read shotgun metagenomics sequencing from different time point samples, we have reconstructed complete genomes. Genomic annotation of these species revealed complementary metabolic functions involving carbon breakdown and vitamin biosynthesis suggesting interactions amongst community members. Using isolated species, we provide experimental support for carbon provision through cyanobacterial slime and growth on the component substrates by representative members of the Proteobacteria and Actinobacteriota phyla. Additionally, we experimentally show vitamin provision and uptake between prototrophic and auxotrophic members. We also found genomic capability for (an)oxygenic photosynthesis and sulfur cycling in several species. We show consistent formation of oxygen gradients across ‘photogranule’ structures, supporting niches that can sustain these specific metabolic functions. These findings indicate that spatial niche formation and metabolic interactions enable maintenance of community compositional stability and diversity. SIGNIFICANCE STATEMENT Microbes exist as species-diverse communities in nature and understanding their stability is an open challenge in microbial ecology. We established and maintained a spatially-organised, photosynthetic microbial community from a freshwater reservoir through long-term culturing in laboratory medium. We found that this community maintained a taxonomically-diverse set of 17 bacterial species. Combining genomic and physiological assays, we characterised a novel filamentous cyanobacterium capable of carbohydrate-rich ‘slime’ secretion supporting growth of other microbes. We predict inter-species vitamin exchanges and identify sulfur cycling and alternative types of photosynthesis that are likely to be favoured in oxygen-free zones identified within the spatial structures. Our findings indicate that metabolic interactions and spatial structures can enable stable microbial coexistence in natural ecosystems.

2 Abstract Gliding motility involves a characteristic back-and-forth movement of cells without flagella, and is seen in diverse bacteria. It is currently unknown how reversal dynamics in gliding motility are coordinated, especially in the case of multi-cellular, filamentous cyanobacteria. Here, we study gliding motility dynamics in a recently described species, capable of extensive gliding motility and collective, macro-structure formation. We find that gliding motility involves filaments rotating and translating through slime tubes, rather than on top of slime. On agar, filaments move back-and-forth on well-defined trajectories, where they display a characteristic speed profile, peaking in the middle of the trajectory. The time spent during each reversal displays a long-tailed distribution, with most reversals being almost instantaneous, while few involve a significant time of no movement. During reversals, individual cells remain mostly coordinated in their motion. Based on these experimental observations, we develop a biophysical model that incorporates cellular propulsive forces, the direction of which is decided by each cell based on mechano-sensing of their neighbors’ motion. This model can capture experimental observations and predicts that loss of mechano-sensing can cause de-coordination of filament ends during reversals. In line with this prediction, we find instances of filaments becoming de-coordinated during reversals and that these instances are associated with plectoneme formation. The presented characterisation of filament movement dynamics and the corresponding physical model will inform future studies on individual and collective filament behaviours under different conditions. 1 Significance Statement Gliding motility is seen in diverse bacteria, but the dynamics of this type of motion and the molecular mechanisms creating propulsive forces are still not fully understood. In some gliding cyanobacteria, many cells remain attached to each other to form a single filament, thus necessitating an intra-cellular coordination of propulsive forces. To better understand such coordination, we study here the dynamics of gliding motility in a filamentous cyanobacteria. We find that, on agar surface, gliding filaments move back-and-forth in a well-defined trajectory and their translation is coupled with rotation along the long axis of the filament. During reversals, cells mostly remain coordinated with each other. These dynamics are captured by a physical model, which predicts that a loss of cell-to-cell coordination can cause loss of smooth reversal. Confirming this prediction, we find that longer filaments can readily get de-coordinated during reversals, resulting in the buckling of filaments and formation of plectonemes. These experimental results and the developed model will inform future studies of molecular mechanisms in single filaments and collective behaviors of many filaments.

Abstract This paper reports on the use of scanning ion conductance microscopy (SICM) to locally map the ionic properties and charge environment of two live bacterial strains: the gramnegative Escherichia coli and the gram-positive Bacillus subtilis . SICM results find heterogeneities across the bacterial surface, and significant differences among the grampositive and -negative bacteria. The bioelectrical environment of the B. subtilis was found to be considerably more negatively charged compared to E. coli . SICM measurements, fitted to a simplified finite element method (FEM) model, revealed surface charge values of −80 to −140 mC m −2 for the gram-negative E. coli . The gram-positive B. subtilis show a much higher conductivity around the cell wall, and surface charge values between −350 and −450 mC m −2 were found using the same simplified model. SICM was also able to detect regions of high negative charge near B. subtilis , not detected in the topographical SICM response and attributed to extracellular polymeric substance. To further explore how the B. subtilis cell wall structure can influence the SICM current response, a more comprehensive FEM model, accounting for the physical properties of the gram-positive cell wall, was developed. The new model provides a more realistic description of the cell wall and allowed investigation of the relation between its key properties and SICM currents, building foundations to further investigate and improve understanding of the gram-positive cellular microenvironment. Abstract Figure

Abstract Ultramicroelectrode (UME), or - equivalently - microelectrode, probes are increasingly used for single-cell measurements of cellular properties and processes, including physiological activity, such as metabolic fluxes and respiration rates. Major challenges for the sensitivity of such measurements include: (i) the relative magnitude of cellular and UME fluxes (manifested in the current); and (ii) issues around the stability of the UME response over time. To explore the extent to which these factors impact the precision of electrochemical cellular measurements, we undertake a systematic analysis of measurement conditions and experimental parameters for determining single cell respiration rates, via the oxygen consumption rate (OCR) at single HeLa cells. Using scanning electrochemical microscopy (SECM), with a platinum UME as the probe, we employ a self-referencing measurement protocol, rarely employed in SECM, whereby the UME is repeatedly approached from bulk solution to a cell, and a short pulse to oxygen reduction reaction (ORR) potentials is performed near the cell and in bulk solution. This approach enables the periodic tracking of the bulk UME response to which the near-cell response is repeatedly compared (referenced), and also ensures that the ORR near the cell is performed only briefly, minimizing the effect of the electrochemical process on the cell. SECM experiments are combined with a finite element method (FEM) modeling framework, to simulate oxygen diffusion and the UME response. Taking a realistic range of single cell OCR to be 1×10 −18 to 1×10 −16 mol s -1 , results from the combination of FEM simulations and self-referencing SECM measurements show that these OCR values are at - or below - the present detection sensitivity of the technique. We provide a set of model-based suggestions for improving these measurements in the future, but highlight that extraordinary improvements in the stability and precision of SECM measurements will be required if single cell OCR measurements are to be realized. TOC

This work presents an experimental platform combining scanning ion conductance microscopy (SICM) with confocal laser scanning microscopy (CLSM), using intra- and extracellular pH indicator dyes to study the impact of acid delivery on individual HeLa cells within a population. The proton gradient generated by the SICM delivery is highly confined by the action of the media buffer, making the challenge local. Temporal and spatial aspects of the delivery are modeled by simulations, allowing for pH gradients across individual cells, even within a group, to be calculated. We find a strong dependency between the intracellular pH and the extracellular pH gradient imposed by local acid delivery. Postdelivery intracellular pH recovery depends on the extent of the acid challenge, with cells exposed to lower pH not returning to basal intracellular pH values after the extracellular pH recovers. This is a unique method for concentration-gradient challenge studies of cell populations that will have broad applications in cell biology. SICM can be used to deliver different chemicals and enables a wide range of local conditions to be applied across a cell population, for which the effects can be investigated at the single-cell level.