ABSTRACT Understanding how microbial communities maintain stable compositional diversity is key for predicting community function. Studies from species pairwise interactions and synthetic communities indicate that metabolic interactions and spatial organisation can influence coexistence, but the relevance of these factors in more complex communities is unclear. Model systems often lack multi-species complexity, thereby making it difficult to study community diversity temporally. Here we used a spatially-organised cyanobacterial enrichment community to investigate compositional diversity and its stability. Over a year of passaging in media without significant carbon source, we found that the community maintains relatively high diversity, with 17 co-existing bacterial species. Using short and long read shotgun metagenomics sequencing from different time point samples, we have reconstructed complete genomes. Genomic annotation of these species revealed complementary metabolic functions involving carbon breakdown and vitamin biosynthesis suggesting interactions amongst community members. Using isolated species, we provide experimental support for carbon provision through cyanobacterial slime and growth on the component substrates by representative members of the Proteobacteria and Actinobacteriota phyla. Additionally, we experimentally show vitamin provision and uptake between prototrophic and auxotrophic members. We also found genomic capability for (an)oxygenic photosynthesis and sulfur cycling in several species. We show consistent formation of oxygen gradients across ‘photogranule’ structures, supporting niches that can sustain these specific metabolic functions. These findings indicate that spatial niche formation and metabolic interactions enable maintenance of community compositional stability and diversity. SIGNIFICANCE STATEMENT Microbes exist as species-diverse communities in nature and understanding their stability is an open challenge in microbial ecology. We established and maintained a spatially-organised, photosynthetic microbial community from a freshwater reservoir through long-term culturing in laboratory medium. We found that this community maintained a taxonomically-diverse set of 17 bacterial species. Combining genomic and physiological assays, we characterised a novel filamentous cyanobacterium capable of carbohydrate-rich ‘slime’ secretion supporting growth of other microbes. We predict inter-species vitamin exchanges and identify sulfur cycling and alternative types of photosynthesis that are likely to be favoured in oxygen-free zones identified within the spatial structures. Our findings indicate that metabolic interactions and spatial structures can enable stable microbial coexistence in natural ecosystems.

2 Abstract Gliding motility involves a characteristic back-and-forth movement of cells without flagella, and is seen in diverse bacteria. It is currently unknown how reversal dynamics in gliding motility are coordinated, especially in the case of multi-cellular, filamentous cyanobacteria. Here, we study gliding motility dynamics in a recently described species, capable of extensive gliding motility and collective, macro-structure formation. We find that gliding motility involves filaments rotating and translating through slime tubes, rather than on top of slime. On agar, filaments move back-and-forth on well-defined trajectories, where they display a characteristic speed profile, peaking in the middle of the trajectory. The time spent during each reversal displays a long-tailed distribution, with most reversals being almost instantaneous, while few involve a significant time of no movement. During reversals, individual cells remain mostly coordinated in their motion. Based on these experimental observations, we develop a biophysical model that incorporates cellular propulsive forces, the direction of which is decided by each cell based on mechano-sensing of their neighbors’ motion. This model can capture experimental observations and predicts that loss of mechano-sensing can cause de-coordination of filament ends during reversals. In line with this prediction, we find instances of filaments becoming de-coordinated during reversals and that these instances are associated with plectoneme formation. The presented characterisation of filament movement dynamics and the corresponding physical model will inform future studies on individual and collective filament behaviours under different conditions. 1 Significance Statement Gliding motility is seen in diverse bacteria, but the dynamics of this type of motion and the molecular mechanisms creating propulsive forces are still not fully understood. In some gliding cyanobacteria, many cells remain attached to each other to form a single filament, thus necessitating an intra-cellular coordination of propulsive forces. To better understand such coordination, we study here the dynamics of gliding motility in a filamentous cyanobacteria. We find that, on agar surface, gliding filaments move back-and-forth in a well-defined trajectory and their translation is coupled with rotation along the long axis of the filament. During reversals, cells mostly remain coordinated with each other. These dynamics are captured by a physical model, which predicts that a loss of cell-to-cell coordination can cause loss of smooth reversal. Confirming this prediction, we find that longer filaments can readily get de-coordinated during reversals, resulting in the buckling of filaments and formation of plectonemes. These experimental results and the developed model will inform future studies of molecular mechanisms in single filaments and collective behaviors of many filaments.

Plasmids are important vectors for the spread of genes among diverse populations of bacteria. However, there is no standard method to determine the rate at which they spread horizontally via conjugation. Here, we compare commonly used methods on simulated data, and show that the conjugation rate estimates often depend strongly on the time of measurement, the initial population densities, or the initial ratio of donor to recipient populations. We derive a new "end-point" measure to estimate conjugation rates, which extends the Simonsen method to include the effects of differences in population growth and conjugation rates from donors and transconjugants. We further derive analytical expressions for the parameter range in which these approximations remain valid. All tools to estimate conjugation rates are available in an R package and Shiny app. The result is a set of guidelines for easy, accurate, and comparable measurement of conjugation rates and tools to verify these rates.