The evolutionary importance of hybridization and introgression has long been debated. Hybrids are usually rare and unfit, but even infrequent hybridization can aid adaptation by transferring beneficial traits between species. Here we use genomic tools to investigate introgression in Heliconius, a rapidly radiating genus of neotropical butterflies widely used in studies of ecology, behaviour, mimicry and speciation. We sequenced the genome of Heliconius melpomene and compared it with other taxa to investigate chromosomal evolution in Lepidoptera and gene flow among multiple Heliconius species and races. Among 12,669 predicted genes, biologically important expansions of families of chemosensory and Hox genes are particularly noteworthy. Chromosomal organization has remained broadly conserved since the Cretaceous period, when butterflies split from the Bombyx (silkmoth) lineage. Using genomic resequencing, we show hybrid exchange of genes between three co-mimics, Heliconius melpomene, Heliconius timareta and Heliconius elevatus, especially at two genomic regions that control mimicry pattern. We infer that closely related Heliconius species exchange protective colour-pattern genes promiscuously, implying that hybridization has an important role in adaptive radiation.

Heliconius butterfly wing pattern mimicry is driven by cis-regulatory variation of the optix gene.

We used 20 de novo genome assemblies to probe the speciation history and architecture of gene flow in rapidly radiating Heliconius butterflies. Our tests to distinguish incomplete lineage sorting from introgression indicate that gene flow has obscured several ancient phylogenetic relationships in this group over large swathes of the genome. Introgressed loci are underrepresented in low-recombination and gene-rich regions, consistent with the purging of foreign alleles more tightly linked to incompatibility loci. Here, we identify a hitherto unknown inversion that traps a color pattern switch locus. We infer that this inversion was transferred between lineages by introgression and is convergent with a similar rearrangement in another part of the genus. These multiple de novo genome sequences enable improved understanding of the importance of introgression and selective processes in adaptive radiation.

Although animals display a rich variety of shapes and patterns, the genetic changes that explain how complex forms arise are still unclear. Here we take advantage of the extensive diversity of Heliconius butterflies to identify a gene that causes adaptive variation of black wing patterns within and between species. Linkage mapping in two species groups, gene-expression analysis in seven species, and pharmacological treatments all indicate that cis -regulatory evolution of the WntA ligand underpins discrete changes in color pattern features across the Heliconius genus. These results illustrate how the direct modulation of morphogen sources can generate a wide array of unique morphologies, thus providing a link between natural genetic variation, pattern formation, and adaptation.

Abstract Despite insertions and deletions being the most common structural variants (SVs) found across genomes, not much is known about how much these SVs vary within populations and between closely related species, nor their significance in evolution. To address these questions, we characterized the evolution of indel SVs using genome assemblies of three closely related Heliconius butterfly species. Over the relatively short evolutionary timescales investigated, up to 18.0% of the genome was composed of indels between two haplotypes of an individual H. charithonia butterfly and up to 62.7% included lineage-specific SVs between the genomes of the most distant species (11 Mya). Lineage-specific sequences were mostly characterized as transposable elements (TEs) inserted at random throughout the genome and their overall distribution was similarly affected by linked selection as single nucleotide substitutions. Using chromatin accessibility profiles (i.e., ATAC-seq) of head tissue in caterpillars to identify sequences with potential cis -regulatory function, we found that out of the 31,066 identified differences in chromatin accessibility between species, 30.4% were within lineage-specific SVs and 9.4% were characterized as TE insertions. These TE insertions were localized closer to gene transcription start sites than expected at random and were enriched for several transcription factor binding site candidates with known function in neuron development in Drosophila . We also identified 24 TE insertions with head-specific chromatin accessibility. Our results show high rates of structural genome evolution that were previously overlooked in comparative genomic studies and suggest a high potential for structural variation to serve as raw material for adaptive evolution.

Abstract Sex chromosomes are disproportionately involved in reproductive isolation and adaptation. In support of such a ‘large-X’ effect, genome scans between recently diverged populations or species pairs often identify distinct patterns of divergence on the sex chromosome compared to autosomes. When measures of divergence between populations are higher on the sex chromosome compared to autosomes, such patterns could be interpreted as evidence for faster divergence on the sex chromosome, i.e. ‘faster-X’, or barriers to gene flow on the sex chromosome. However, demographic changes can strongly skew divergence estimates and are not always taken into consideration. We used 224 whole genome sequences representing 36 populations from two Heliconius butterfly clades ( H. erato and H. melpomene ) to explore patterns of Z chromosome divergence. We show that increased divergence compared to equilibrium expectations can in many cases be explained by demographic change. Among Heliconius erato populations, for instance, population size increase in the ancestral population can explain increased absolute divergence measures on the Z chromosome compared to the autosomes, as a result of increased ancestral Z chromosome genetic diversity. Nonetheless, we do identify increased divergence on the Z chromosome relative to the autosomes in parapatric or sympatric species comparisons that imply post-zygotic reproductive barriers. Using simulations, we show that this is consistent with reduced gene flow on the Z chromosome, perhaps due to greater accumulation of species incompatibilities. Our work demonstrates the importance of constructing an appropriate demographic null model in order to interpret patterns of divergence on the Z chromosome, but nonetheless provides evidence to support the Z chromosome as a strong barrier to gene flow in incipient Heliconius butterfly species.

Abstract Evolutionary variation in the wing pigmentation of butterflies and moths offers striking examples of adaptation by crypsis and mimicry. The cortex locus has been independently mapped as the locus controlling colour polymorphisms in 14 lepidopteran species, suggesting it acts as a genomic hotspot for the diversification of wing patterns, but functional validation through protein-coding knockouts has proven difficult to obtain. Our study unveils the role of a novel long non-coding RNA (lncRNA) which we name ivory , transcribed from the cortex locus, in modulating colour patterning in butterflies. Strikingly, ivory expression prefigures most melanic patterns during pupal development, suggesting an early developmental role in specifying scale identity. To test this, we generated CRISPR mosaic knock-outs in five nymphalid butterfly species and show that ivory mutagenesis yields transformations of dark pigmented scales into white or light-coloured scales. Genotyping of Vanessa cardui germline mutants associates these phenotypes to small on-target deletions at the conserved first exon of ivory . In contrast, cortex germline mutant butterflies with confirmed null alleles lack any wing phenotype, and exclude a colour patterning role for this adjacent gene. Overall, these results show that a lncRNA acts as a master switch of colour pattern specification, and played key roles in the adaptive diversification of colour patterns in butterflies. Significance statement Deciphering the genetic underpinnings of adaptive variation is fundamental for a comprehensive understanding of evolutionary processes. Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent an emerging category of genetic modulators within the genome, yet they have been overlooked as a source of phenotypic diversity. In this study, we unveil the pivotal role of a lncRNA in orchestrating colour transitions between dark and light patterns during butterfly wing development. Remarkably, this lncRNA gene is nested within the cortex locus, a genetic region known to control multiple cases of adaptive variation in butterflies and moths, including iconic examples of natural selection. These findings highlight the significant influence of lncRNAs in developmental regulation, and also underscore their potential as key genetic players in the evolutionary process itself.

Mullerian mimicry strongly exemplifies the power of natural selection. However, the exact measure of such adaptive phenotypic convergence and the possible causes of its imperfection often remain unidentified. The butterfly species Heliconius erato and Heliconius melpomene have a large diversity of co-mimicking geographic races with remarkable resemblance in melanic patterning across the mid-forewing that has been linked to expression patterns of the gene WntA . Recent CRISPR/Cas9 experiments have informed us on the exact areas of the wings in which WntA affects color pattern formation in both H. erato and H. melpomene , thus providing a unique comparative dataset to explore the functioning of a gene and its potential effect on phenotypic evolution. We therefore quantified wing color pattern differences in the mid-forewing region of 14 co-mimetic races of H. erato and H. melpomene and measured the extent to which mimicking races are not perfectly identical. While the relative size of the mid-forewing pattern is generally nearly identical, our results highlight the areas of the wing that prevent these species from achieving perfect mimicry and demonstrate that this mismatch can be largely explained by constraints imposed by divergence in the gene regulatory network that define wing color patterning. Divergence in the developmental architecture of a trait can thus constrain morphological evolution even between relatively closely related species.

Hybrid zones can be valuable tools for studying evolution and identifying genomic regions responsible for adaptive divergence and underlying phenotypic variation. Hybrid zones between subspecies of Heliconius butterflies can be very narrow and are maintained by strong selection acting on colour pattern. The co-mimetic species H. erato and H. melpomene have parallel hybrid zones where both species undergo a change from one colour pattern form to another. We use restriction associated DNA sequencing to obtain several thousand genome wide sequence markers and use these to analyse patterns of population divergence across two pairs of parallel hybrid zones in Peru and Ecuador. We compare two approaches for analysis of this type of data; alignment to a reference genome and de novo assembly, and find that alignment gives the best results for species both closely (H. melpomene) and distantly (H. erato, ~15% divergent) related to the reference sequence. Our results confirm that the colour pattern controlling loci account for the majority of divergent regions across the genome, but we also detect other divergent regions apparently unlinked to colour pattern differences. We also use association mapping to identify previously unmapped colour pattern loci, in particular the Ro locus. Finally, we identify within our sample a new cryptic population of H. timareta in Ecuador, which occurs at relatively low altitude and is mimetic with H. melpomene malleti.

The use of image data to quantify, study and compare variation in the colors and patterns of organisms requires the alignment of images to establish homology, followed by color-based segmentation of images. Here we describe an R package for image alignment and segmentation that has applications to quantify color patterns in a wide range of organisms. patternize is an R package that quantifies variation in color patterns obtained from image data. patternize first defines homology between pattern positions across specimens either through manually placed homologous landmarks or automated image registration. Pattern identification is performed by categorizing the distribution of colors using an RGB threshold, k-means clustering or watershed transformation. We demonstrate that patternize can be used for quantification of the color patterns in a variety of organisms by analyzing image data for butterflies, guppies, spiders and salamanders. Image data can be compared between sets of specimens, visualized as heatmaps and analyzed using principal component analysis (PCA). patternize has potential applications for fine scale quantification of color pattern phenotypes in population comparisons, genetic association studies and investigating the basis of color pattern variation across a wide range of organisms.