ABSTRACT Cell surface membrane proteins perform diverse and critical functions and are spatially and temporally regulated by membrane trafficking pathways. Although perturbations in these pathways underlie many pathologies, our understanding of these pathways at a mechanistic level remains incomplete. Using yeast as a model, we have developed an assay that reports on the surface activity of the Fur4 uracil permease in uracil auxotroph strains grown in the presence of limited uracil. This assay was used to screen a haploid deletion library that identified mutants with both diminished and enhanced comparative growth in restricted uracil media. Factors identified, including various multi-subunit complexes, were enriched for membrane trafficking and transcriptional functions, in addition to various uncharacterised genes. Bioinformatic analysis of expression profiles from many strains lacking identified transcription factors required for efficient uracil-scavenging revealed they control expression of other uracil-scavenging factors, in addition to membrane trafficking genes essential for viability, and therefore not represented in the screen. Finally, we performed a secondary mating factor secretion screen to functionally categorise factors implicated in uracil-scavenging, most of which are conserved throughout evolution.

ABSTRACT Trafficking of cell surface membrane proteins to and from the plasma membrane impinges on myriad biological processes and ensures correct cellular function. Upon internalization, many surface proteins are recycled back to the plasma membrane. Although these endosomal trafficking pathways control surface protein activity, the precise regulatory features and division of labour between interconnected pathways is poorly defined. Furthermore, how well endosomal trafficking mechanisms are conserved is unclear. In yeast, we show cargo recycling back to the surface occurs through distinct pathways. In addition to retrograde recycling pathways via the late Golgi, used by synaptobrevins and driven by cargo ubiquitination, we find nutrient transporter recycling bypasses the Golgi in a pathway driven by cargo deubiquitination. Nutrient transporters rapidly internalize to, and recycle from, endosomes marked by Vps4 and the ESCRT-III associated factor Ist1. This compartment serves as both ‘early’ and ‘recycling’ endosome, implying these features are evolutionarily conserved. Ist1 has previously been implicated in recycling in yeast and other eukaryotes. We show Ist1 is ubiquitinated and this is required for proper endosomal recruitment and cargo recycling to the surface. Additionally, the ubiquitin-binding adaptor Npl4 and the essential ATPase Cdc48 are required for cargo recycling possibly through regulation of ubiquitinated Ist1. This collectively suggests mechanistic features of recycling from endosomes to the plasma membrane are also conserved.

ABSTRACT Cell surface protein trafficking is regulated in response to nutrient availability, with multiple pathways directing surface membrane proteins to the lysosome for degradation in response to suboptimal extracellular nutrients. Internalised protein and lipid cargoes recycle back to the surface efficiently in glucose replete conditions, but this trafficking is attenuated following glucose starvation. We find cells with either reduced or hyperactive phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activity are defective for recycling. Furthermore, we find the yeast Gα subunit Gpa1, an endosomal PI3K effector, is required for surface recycling of cargoes. Following glucose starvation, mRNA and protein levels of a distinct Gα subunit Gpa2 are elevated following nuclear translocation of Mig1, which inhibits recycling of various cargoes. As Gpa1 and Gpa2 interact at the surface where Gpa2 concentrates during glucose starvation, we propose this disrupts PI3K activity required for recycling, potentially diverting Gpa1 to the surface and interfering with its endosomal role in recycling. In support of this model, glucose starvation and over-expression of Gpa2 alters PI3K endosomal phosphoinositide production. Glucose deprivation therefore triggers a survival mechanism to increase retention of surface cargoes in endosomes and promote their lysosomal degradation.

1. Abstract Cells employ myriad regulatory mechanisms to maintain protein homeostasis, termed proteostasis, to ensure correct cellular function. Dysregulation of proteostasis, which is often induced by physiological stress and ageing, often results in protein aggregation in cells. These aggregated structures can perturb normal physiological function, compromising cell integrity and viability, a prime example being early onset of several neurodegenerative diseases. Understanding aggregate dynamics in vivo is therefore of strong interest for biomedicine and pharmacology. However, factors involved in formation, distribution and clearance of intracellular aggregates are not fully understood. Here, we report an improved methodology for production of fluorescent aggregates in model budding yeast which can be detected, tracked and quantified using fluorescence microscopy in live cells. This new openly-available technology, iPAR (inducible Protein Aggregation Reporter), involves monomeric fluorescent protein reporters fused to a ΔssCPY* aggregation biomarker, with expression controlled under the copper-regulated CUP1 promoter. Monomeric tags overcome challenges associated with non-physiological reporter aggregation, whilst CUP1 provides more precise control of protein production. We show that iPAR and the associated bioimaging methodology enables quantitative study of cytoplasmic aggregate kinetics and inheritance features in vivo . We demonstrate that iPAR can be used with traditional epifluorescence and confocal microscopy as well as single-molecule precise Slimfield millisecond microscopy. Our results indicate that cytoplasmic aggregates are mobile and contain a broad range of number of iPAR molecules, from tens to several hundred per aggregate, whose mean value increases with extracellular hyperosmotic stress. Time lapse imaging shows that although larger iPAR aggregates associate with nuclear and vacuolar compartments, and for the first time we show directly that these proteotoxic accumulations are not inherited by daughter cells, unlike nuclei and vacuoles. If suitably adapted, iPAR offers new potential for studying diseases relating to protein oligomerization processes in other model cellular systems.

ABSTRACT The yeast plasma membrane (PM) is organised into specific subdomains that regulate surface membrane proteins. Surface transporters actively uptake nutrients in particular regions of the PM where they are also susceptible to substrate induced endocytosis. However, transporters also diffuse into distinct subdomains termed eisosomes, where they are protected from endocytosis. Although most nutrient transporter populations are downregulated in the vacuole following glucose starvation, a small pool is retained in eisosomes to provide efficient recovery from starvation. We find the core eisosome subunit Pil1, a Bin, Amphiphysin and Rvs (BAR) domain protein required for eisosome biogenesis, is phosphorylated primarily by the kinase Pkh2. In response to acute glucose starvation, Pil1 is rapidly dephosphorylated. Enzyme localisation and activity screens implicate the phosphatase Glc7 is the primary enzyme responsible for Pil1 dephosphorylation. Both depletion of GLC7 and phospho-ablative or phospho-mimetic mutations of Pil1 correlate with Pil1 phosphorylation status, failure to properly retain transporters in eisosomes, and results in defective starvation recovery. We propose precise posttranslational control of Pil1 modulates nutrient transporter retention within eisosomes depending on extracellular nutrient levels, to maximise recovery following starvation.

Although some budding yeasts have proved tractable and intensely studied models, others are more recalcitrant. Debaryomyces hansenii, an important yeast species in food and biotechnological industries with curious physiological characteristics, has proved difficult to manipulate genetically and remains poorly defined. To remedy this, we have combined live cell fluorescent dyes with high-resolution imaging techniques to define the sub-cellular features of D. hansenii, such as the mitochondria, nuclei, vacuoles and the cell wall. Using these tools, we define biological processes like the cell cycle, organelle inheritance and various membrane trafficking pathways of D. hansenii for the first time. Beyond this, reagents designed to study Saccharomyces cerevisiae proteins were used to access proteomic information about D. hansenii. Finally, we optimised the use of label-free holotomography to image yeast, defining the physical parameters and visualising sub-cellular features like membranes and vacuoles. Not only does this work shed light on D. hansenii but this combinatorial approach serves as a template for how other cell biological systems, which are not amenable to standard genetic procedures, can be studied.

Abstract The physical and chemical environment inside cells is of fundamental importance to all life but has traditionally been difficult to determine on a subcellular basis. Here we combine cutting-edge genomically integrated FRET biosensing to readout localized molecular crowding in single live yeast cells. Confocal microscopy allows us to build subcellular crowding heatmaps using ratiometric FRET, while whole-cell analysis demonstrates crowding is reduced when yeast is grown in elevated glucose concentrations. Simulations indicate that the cell membrane is largely inaccessible to these sensors and that cytosolic crowding is broadly uniform across each cell over a timescale of seconds. Millisecond single-molecule optical microscopy was used to track molecules and obtain brightness estimates that enabled calculation of crowding sensor copy numbers. The quantification of diffusing molecule trajectories paves the way for correlating subcellular processes and the physicochemical environment of cells under stress.

Abstract In eukaryotes, intracellular physicochemical properties like macromolecular crowding and cytoplasmic viscoelasticity influence key processes such as metabolic activities, molecular diffusion, and protein folding. However, mapping crowding and viscoelasticity in living cells remains challenging. One approach uses passive rheology in which diffusion of exogenous fluorescent particles internalised in cells is tracked and physicochemical properties inferred from derived mean square displacement relations. Recently, the crGE2.3 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensor was developed to quantify crowding in cells, though it is unclear how this readout depends on viscoelasticity and the molecular weight of the crowder. Here, we present correlative, multidimensional data to explore diffusion and molecular crowding characteristics of molecular crowding agents using super-resolved fluorescence microscopy and ensemble time-resolved spectroscopy. We firstly characterise in vitro and then apply these insights to live cells of budding yeast Saccharomyces cerevisiae . It is to our knowledge the first time this has been attempted. We demonstrate that these are usable both in vitro and in the case of endogenously expressed sensors in live cells. Finally, we present a method to internalise fluorescent beads as in situ viscoelasticity markers in the cytoplasm of live yeast cells, and discuss limitations of this approach including impairment of cellular function.

ABSTRACT Intracellular trafficking pathways control residency and bioactivity of integral membrane proteins at the cell surface. Upon internalisation, surface cargo proteins can be delivered back to the plasma membrane via endosomal recycling pathways. Recycling is thought to be controlled at the metabolic and transcriptional level, but such mechanisms are not fully understood. In yeast, recycling of surface proteins can be triggered by cargo deubiquitination and a series of molecular factors have been implicated in this trafficking. In this study, we follow up on the observation that many subunits of the Rpd3 lysine deacetylase complex are required for recycling. We validate ten Rpd3-complex subunits in recycling using two distinct assays and developed tools to quantify both. Fluorescently labelled Rpd3 localises to the nucleus and complements recycling defects, which we hypothesised were mediated by modulated expression of Rpd3 target gene(s). Bioinformatics implicated 32 candidates that function downstream of Rpd3, which were over-expressed and assessed for capacity to suppress recycling defects of rpd3Δ cells. This effort yielded 3 hits: Sit4, Dit1 and Ldb7, which were validated with a lipid dye recycling assay. Additionally, the essential phosphatidylinositol-4-kinase Pik1 was shown to have a role in recycling. We propose recycling is governed by Rpd3 at the transcriptional level via multiple downstream target genes.

ABSTRACT Although some budding yeasts have proved tractable and intensely studied models, others are more recalcitrant. Debaryomyces hansenii , an important yeast species in food and biotechnological industries with curious physiological characteristics, has proved difficult to manipulate genetically and remains poorly defined. To remedy this, we have combined live cell fluorescent dyes with high resolution imaging techniques to define the sub-cellular features of D. hansenii , such as the mitochondria, nuclei, vacuoles and the cell wall. Using these tools, we define biological processes like the cell cycle, organelle inheritance and different membrane trafficking pathways of D. hansenii for the first time. Beyond this, reagents designed to study Saccharomyces cerevisiae proteins were used to access proteomic information about D. hansenii . Finally, we optimised the use of label free holotomography to image yeast, defining the physical parameters and visualising sub-cellular features like membranes and vacuoles. Not only does this work shed light on D. hansenii but this combinatorial approach serves as a template for how other cell biological systems, which are not amenable to standard genetic procedures, can be studied.