SUMMARY Chronic stimulation can cause T cell dysfunction and limit efficacy of cellular immunotherapies. CRISPR screens have nominated gene targets for engineered T cells, but improved methods are required to compare large numbers of synthetic knockin sequences to reprogram cell functions. Here, we developed Modular Pooled Knockin Screening (ModPoKI), an adaptable platform for modular construction of DNA knockin libraries using barcoded multicistronic adaptors. We built two ModPoKI libraries of 100 transcription factors (TFs) and 129 natural and synthetic surface receptors. Over 20 ModPoKI screens across human TCR and CAR T cells in diverse conditions identified a transcription factor AP4 (TFAP4) construct to enhance long-term T cell fitness and anti-cancer function in vitro and in vivo . ModPoKI’s modularity allowed us to generate a ∼10,000-member library of TF combinations. Non-viral knockin of a combined BATF-TFAP4 polycistronic construct further enhanced function in vivo . ModPoKI facilitates discovery of complex gene constructs to program cellular functions. Highlights Modular pooled knockins of hundreds of TF and surface receptor constructs combined with different antigen receptors Chronic stimulation screens discover programs to improve T cell persistence Combinatorial knockin screens with ∼10,000 transcription factor combinations BATF-TFAP4 dual knockin construct improves CAR T cell function in vitro and in vivo

Abstract Multiplexed reprogramming of T cell specificity and function can generate powerful next-generation cellular therapies. However, current manufacturing methods produce heterogenous mixtures of partially engineered cells. Here, we develop a one-step process to enrich for unlabeled cells with knock-ins at multiple target loci using a family of repair templates named S ynthetic E xon/ E xpression Disruptors (SEEDs). SEED engineering associates transgene integration with the disruption of a paired endogenous surface protein, allowing non-modified and partially edited cells to be immunomagnetically depleted (SEED-Selection). We design SEEDs to fully reprogram three critical loci encoding T cell specificity, co-receptor expression, and MHC expression, with up to 98% purity after selection for individual modifications and up to 90% purity for six simultaneous edits (three knock-ins and three knockouts). These methods are simple, compatible with existing clinical manufacturing workflows, and can be readily adapted to other loci to facilitate production of complex gene-edited cell therapies.

ABSTRACT There is currently a lack of tools capable of perturbing genes in both a precise and spatiotemporal fashion. CRISPR’s ease of use and flexibility, coupled with light’s unparalleled spatiotemporal resolution deliverable from a controllable source, makes optogenetic CRISPR a well-suited solution for precise spatiotemporal gene perturbations. Here we present a new optogenetic CRISPR tool, BLU-VIPR, that diverges from prevailing split-Cas design strategies and instead focuses on optogenetic regulation of gRNA production. This simplifies spatiotemporal gene perturbation and works in vivo with cells previously intractable to optogenetic gene editing. We engineered BLU-VIPR around a new potent blue-light activated transcription factor and ribozyme-flanked gRNA. The BLU-VIPR design is genetically encoded and ensures precise excision of multiple gRNAs from a single mRNA transcript, allowing for optogenetic gene editing in T lymphocytes in vivo.

The introduction of immune checkpoint blockade has revolutionized the treatment of metastatic melanoma. However, 40-60% of patients with metastatic melanoma do not respond to immune checkpoint blockade, and a significant fraction of patients acquire resistance to treatment. This resilience and aggressiveness of melanoma tumors is partly due to their ability to switch between invasive and proliferative states. The transition between phenotypic states indicates that phenotype switching occurs through reversible epigenetic mechanisms rather than by acquisition of mutations. Identifying the epigenetic mechanisms that underlie phenotype switching of melanoma cells could potentially lead to new therapeutic strategies. Here we report that the bromodomain protein TRIM28 (KAP1/TIF1b) regulates a JUNB dependent phenotypic switch in melanoma cells. Knockdown of TRIM28 in melanoma cells reduced the expression of pro-invasive YAP1 signature genes, and led to reduced invasiveness and lung colonization. In contrast, TRIM28 knockdown increased the expression of KRAS signature genes and promoted tumor growth. TRIM28 interacted with the transcriptional elongation factors CDK9 and HEXIM1, and negatively regulated the transcriptional elongation of JUNB by RNA polymerase II. Rescue experiments demonstrated that the effects of TRIM28 knockdown were directly mediated by JUNB. Mechanistically, JUNB played a pivotal role in phenotype switching by inhibiting the invasiveness of melanoma cells and increasing the growth of melanoma tumors. Our results contribute to the understanding of melanoma plasticity, and suggest that cancer drugs inhibiting the transcriptional elongation of RNA polymerase II should be carefully evaluated in melanoma to exclude the risk for increased metastasis.

Adoptive chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) therapy is transformative and approved for hematologic malignancies, as well being developed for treatment of solid tumors, autoimmune disorders, heart disease and aging. Despite unprecedented clinical outcomes, CAR-T and other engineered cell therapies face a variety of manufacturing and safety challenges. Traditional methods, like lentivirus transduction and electroporation, result in random integration or cause significant cellular damage, which can limit the safety and efficacy of engineered cell therapies, such as CAR-T. We present hydroporation as a gentle and effective alternative for intracellular delivery. Hydroporation resulted in 1.7 to 2x higher CAR-T yields compared to electroporation with superior cell viability and recovery. Hydroporated cells exhibited rapid proliferation, robust target cell lysis and increased pro-inflammatory and regulatory cytokine secretion in addition to improved CAR-T yield by day 5 post-transfection. We demonstrated scaled-up hydroporation can process 5 x 10