Identifying genes involved in biological processes is critical for understanding the molecular building blocks of life. We used engineered CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) to efficiently mutate specific loci in zebrafish (Danio rerio) and screen for genes involved in vertebrate biological processes. We found that increasing CRISPR efficiency by injecting optimized amounts of Cas9-encoding mRNA and multiplexing single guide RNAs (sgRNAs) allowed for phenocopy of known mutants across many phenotypes in embryos. We performed a proof-of-concept screen in which we used intersecting, multiplexed pool injections to examine 48 loci and identified two new genes involved in electrical-synapse formation. By deep sequencing target loci, we found that 90% of the genes were effectively screened. We conclude that CRISPR can be used as a powerful reverse genetic screening strategy in vivo in a vertebrate system.

ABSTRACT People with underlying conditions, including hypertension, obesity, and diabetes, are especially susceptible to negative outcomes after infection with the coronavirus SARS-CoV-2. These COVID-19 comorbidities are exacerbated by the Renin-Angiotensin-Aldosterone System (RAAS), which normally protects from rapidly dropping blood pressure or dehydration via the peptide Angiotensin II (Ang II) produced by the enzyme Ace. The Ace paralog Ace2 degrades Ang II, thus counteracting its chronic effects. Ace2 is also the SARS-CoV-2 receptor. Ace , the coronavirus, and COVID-19 comorbidities all regulate Ace2 , but we don’t yet understand how. To exploit zebrafish ( Danio rerio ) as a disease model to understand mechanisms regulating the RAAS and its relationship to COVID-19 comorbidities, we must first identify zebrafish orthologs and co-orthologs of human RAAS genes, and second, understand where and when these genes are expressed in specific cells in zebrafish development. To achieve these goals, we conducted genomic analyses and investigated single cell transcriptomes. Results showed that most human RAAS genes have an ortholog in zebrafish and some have two or more co-orthologs. Results further identified a specific intestinal cell type in zebrafish larvae as the site of expression for key RAAS components, including Ace, Ace2, the coronavirus co-receptor Slc6a19, and the Angiotensin-related peptide cleaving enzymes Anpep and Enpep. Results also identified specific vascular cell subtypes as expressing Ang II receptors, apelin , and apelin receptor genes. These results identify specific genes and cell types to exploit zebrafish as a disease model for understanding the mechanisms leading to COVID-19 comorbidities. SUMMARY STATEMENT Genomic analyses identify zebrafish orthologs of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System that contribute to COVID-19 comorbidities and single-cell transcriptomics show that they act in a specialized intestinal cell type.

Summary Cephalopods have a remarkable visual system, with a camera-type eye, high acuity vision, and a wide range of sophisticated visual behaviors. However, the cephalopod brain is organized dramatically differently from that of vertebrates, as well as other invertebrates, and little is known regarding the cell types and molecular determinants of their visual system organization beyond neuroanatomical descriptions. Here we present a comprehensive single-cell molecular atlas of the octopus optic lobe, which is the primary visual processing structure in the cephalopod brain. We combined single-cell RNA sequencing with RNA fluorescence in situ hybridization to both identify putative molecular cell types and determine their anatomical and spatial organization within the optic lobe. Our results reveal six major neuronal cell classes identified by neurotransmitter/neuropeptide usage, in addition to non-neuronal and immature neuronal populations. Moreover, we find that additional markers divide these neuronal classes into subtypes with distinct anatomical localizations, revealing cell type diversity and a detailed laminar organization within the optic lobe. We also delineate the immature neurons within this continuously growing tissue into subtypes defined by evolutionarily conserved fate specification genes as well as novel cephalopod- and octopus-specific genes. Together, these findings outline the organizational logic of the octopus visual system, based on functional determinants, laminar identity, and developmental markers/pathways. The resulting atlas presented here delineates the “parts list” of the neural circuits used for vision in octopus, providing a platform for investigations into the development and function of the octopus visual system as well as the evolution of visual processing. Highlights Single-cell RNA sequencing coupled with RNA fluorescence in situ hybridization produces a molecular taxonomy of cell types in the octopus visual system. Six major neuronal cell classes are delineated based on neurotransmitters/neuropeptides, and are further subdivided based on laminar organization and additional marker genes. Immature neurons are divided into multiple transcriptional subgroups that correspond to mature cell types, delineated by expression of genes known for their developmental roles in other organisms as well as apparent novel genes. This atlas provides the foundation for future studies of the function, development, and comparative evolution of visual processing in cephalopods.

Sex chromosomes are critical elements of sexual reproduction in many animal and plant taxa, however they show incredible diversity and rapid turnover even within clades. Here, using a chromosome-level assembly generated with long read sequencing, we report the first evidence for genetic sex determination in cephalopods. We have uncovered a sex chromosome in California two-spot octopus ( Octopus bimaculoides ) in which males/females show ZZ/ZO karyotypes respectively. We show that the octopus Z chromosome is an evolutionary outlier with respect to divergence and repetitive element content as compared to other chromosomes and that it is present in all coleoid cephalopods that we have examined. Our results suggest that the cephalopod Z chromosome originated between 455 and 248 million years ago and has been conserved to the present, making it the among the oldest conserved animal sex chromosomes known.

Abstract Animal development requires coordinated communication between cells. The Connexin family of proteins is a major contributor to intercellular communication in vertebrates by forming gap junction channels that facilitate the movement of ions, small molecules, and metabolites between cells. Additionally, individual hemichannels can provide a conduit to the extracellular space for paracrine and autocrine signaling. Connexin-mediated communication is well appreciated in epithelial, neural, and vascular development and homeostasis, and most tissues likely use this form of communication. In fact, Connexin disruptions are of major clinical significance contributing to disorders developing from all major germ layers. Despite the fact that Connexins serve as an essential mode of cellular communication, the temporal and cell-type specific expression patterns of connexin genes remain unknown in vertebrates. A major challenge is the large and complex connexin gene family. To overcome this barrier, we probed the expression of all connexins in zebrafish using single-cell RNA-sequencing of entire animals across several stages of organogenesis. Our analysis of expression patterns has revealed that few connexins are broadly expressed, but rather, most are expressed in tissue- or cell-type-specific patterns. Additionally, most tissues possess a unique combinatorial signature of connexin expression with dynamic temporal changes across the organism, tissue, and cell. Our analysis has identified new patterns for well-known connexins and assigned spatial and temporal expression to genes with no-existing information. We provide a field guide relating zebrafish and human connexin genes as a critical step towards understanding how Connexins contribute to cellular communication and development throughout vertebrate organogenesis.

Abstract The subcellular positioning of synapses and their specialized molecular compositions form the fundamental basis of neural circuits. Like chemical synapses, electrical synapses are constructed from an assortment of adhesion, scaffolding, and regulatory molecules, yet little is known about how these molecules localize at specified subcellular neuronal compartments. Here we investigated the relationship between the autism- and epilepsy-associated gene Neurobeachin, neuronal gap junction channelforming Connexins, and the scaffold ZO1. Using the zebrafish Mauthner circuit we found Neurobeachin localizes to the electrical synapse independent of ZO1 and Connexins. By contrast, we show Neurobeachin is required postsynaptically for the robust localization of ZO1 and Connexins. We demonstrate Neurobeachin binds ZO1 but not Connexins. Finally, we find Neurobeachin is required to restrict postsynaptic electrical synapse proteins to dendrites. These findings reveal a mechanism for the asymmetric synaptic localization of electrical synapse components providing a basis for the subcellular specialization of neuronal gap junctions.

SUMMARY Electrical synaptic transmission relies on neuronal gap junctions containing channels constructed by Connexins. While at chemical synapses neurotransmitter-gated ion channels are critically supported by scaffolding proteins, it is unknown if channels at electrical synapses require similar scaffold support. Here we investigated the functional relationship between neuronal Connexins and Zonula Occludens 1 (ZO1), an intracellular scaffolding protein localized to electrical synapses. Using model electrical synapses in zebrafish Mauthner cells, we demonstrated that ZO1 is required for robust synaptic Connexin localization, but Connexins are dispensable for ZO1 localization. Disrupting this hierarchical ZO1/Connexin relationship abolishes electrical transmission and disrupts Mauthner-cell-initiated escape responses. We found that ZO1 is asymmetrically localized exclusively postsynaptically at neuronal contacts where it functions to assemble intercellular channels. Thus, forming functional neuronal gap junctions requires a postsynaptic scaffolding protein. The critical function of a scaffolding molecule reveals an unanticipated complexity of molecular and functional organization at electrical synapses.

Abstract Electrical synapses are neuronal gap junction (GJ) channels associated with a macromolecular complex called the electrical synapse density (ESD), which regulates development and dynamically modifies electrical transmission. However, the proteomic makeup and molecular mechanisms utilized by the ESD that direct electrical synapse formation are not well understood. Using the Mauthner cell of zebrafish as a model, we previously found that the intracellular scaffolding protein ZO1b is a member of the ESD, localizing postsynaptically, where it is required for GJ channel localization, electrical communication, neural network function, and behavior. Here, we show that the complexity of the ESD is further diversified by the genomic structure of the ZO1b gene locus. The ZO1b gene is alternatively initiated at three transcriptional start sites resulting in isoforms with unique N-termini that we call ZO1b-Alpha, -Beta, and - Gamma. We demonstrate that ZO1b-Beta and ZO1b-Gamma are broadly expressed throughout the nervous system and localize to electrical synapses. By contrast, ZO1b-Alpha is expressed mainly non-neuronally and is not found at synapses. We generate mutants in all individual isoforms, as well as double mutant combinations in cis on individual chromosomes, and find that ZO1b-Beta is necessary and sufficient for robust GJ channel localization. ZO1b-Gamma, despite its localization to the synapse, plays an auxiliary role in channel localization. This study expands the notion of molecular complexity at the ESD, revealing that an individual genomic locus can contribute distinct isoforms to the macromolecular complex at electrical synapses. Further, independent scaffold isoforms have differential contributions to developmental assembly of the interneuronal GJ channels. We propose that ESD molecular complexity arises both from the diversity of unique genes and from distinct isoforms encoded by single genes. Overall, ESD proteomic diversity is expected to have critical impacts on the development, structure, function, and plasticity of electrical transmission.

Abstract To investigate electrical synapse formation in vivo we used forward genetics to disrupt genes affecting Mauthner cell electrical synapses in larval zebrafish. We identify the disconnect2 ( dis2 ) mutation for its failure to localize neural gap junction channels at electrical synapses. We mapped this mutation to chromosome 25 and identified a splice-altering mutation in the tjp1b gene. We demonstrated that the dis2 mutation disrupts tjp1b function using complementation analysis with CRISPR generated mutants. We conclude that the dis2 mutation disrupts the tjp1b gene that is required for electrical synapse formation. Description Neural networks are circuits of neurons wired together during development that provide an animal with specialized behavioral outputs. Dedicated adhesions called neuronal synapses create sites of communication between neurons and can be categorized as either electrical or chemical. This work identifies a new mutation in tjp1b that is shown to be required for electrical synapse formation.