Abstract Direct RNA sequencing with a commercial nanopore platform was used to sequence RNA containing uridine (U), pseudouridine (Ψ), or N1-methylpseudouridine (m 1 Ψ) generated by in vitro transcription (IVT). The base calling data as well as the ionic currents and dwell times for U, Ψ, or m 1 Ψ as they translocated through the helicase and nanopore proteins identified diagnostic signatures for Ψ and m 1 Ψ; however, the two modifications yielded similar patterns although both were different from U. Understanding the nanopore signatures for Ψ and m 1 Ψ enabled a running start T7 RNA polymerase assay to study how competing mixtures of UTP with ΨTP or m 1 ΨTP lead to nucleotide selection in all possible adjacent sequence contexts. For UTP vs. ΨTP, ΨTP was favorably incorporated in singly-modified contexts, while doubly-modified contexts found high yields of ΨTP insertion on the 5′ side and lower yields on the 3′ side. For UTP vs. m 1 ΨTP, UTP was favorably selected except in 5′-XA (X = U or m 1 Ψ) where the ratio was determined by their relative NTP concentrations. Experiments with chemically-modified triphosphates and DNA templates designed based on the structure of T7 RNA polymerase provide a model to explain the observations. These results may aid in future efforts that employ IVT to make therapeutic mRNAs with sub-stochiometric amounts of m 1 Ψ.

Abstract The base excision repair enzyme apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 (APE1) is also engaged in transcriptional regulation. APE1 can function in both pathways when the protein binds to a promoter G-quadruplex (G4) bearing an abasic site (modeled with tetrahydrofuran, F) that leads to enzymatic stalling on the non-canonical fold to recruit activating transcription factors. Biochemical and biophysical studies to address APE1’s binding and catalytic activity with the vascular endothelial growth factor ( VEGF ) promoter G4 are lacking, and the present work provides insight on this topic. Herein, the native APE1 was used for cleavage assays, and the catalytically inactive mutant D210A was used for binding assays with double-stranded DNA (dsDNA) versus the native G4 or the G4 with F at various positions, revealing dependencies of the interaction on the cation concentrations K + and Mg 2+ and the N-terminal domain of the protein. Assays in 0, 1, or 10 mM Mg 2+ found dsDNA and G4 substrates required the cation for both binding and catalysis, in which G4 binding increased with [Mg 2+ ]. Studies with 50 versus physiological 140 mM K + ions present showed that F-containing dsDNA was bound and cleaved by APE1; whereas, the G4s with F were poorly cleaved in low salt and not cleaved at all at higher salt while the binding remained robust. Using Δ33 or Δ61 N-terminal truncated APE1 proteins, the binding and cleavage of dsDNA with F was minimally impacted; in contrast, the G4s required the N-terminus for binding and catalysis. With this knowledge, we found APE1 could remodel the F-containing VEGF promoter dsDNA→G4 folds in solution. Lastly, the addition of the G4 ligand pyridostatin inhibited APE1 binding and cleavage of F-containing G4s but not dsDNA. The biological and medicinal chemistry implications of the results are discussed. TOC graphic

Abstract In the last decade, several novel functions of the mammalian Apurinic/Apyrimidinic Endodeoxyribonuclease 1 (APE1) have been discovered, going far beyond its canonical function as a DNA repair enzyme, unveiling its potential roles in cancer development. Indeed, it was shown to be involved in DNA G-quadruplex biology and RNA metabolism, most importantly in the miRNA maturation pathway and the decay of oxidized- or abasic-miRNAs during oxidative stress conditions. Furthermore, in recent years several non-canonical pathways of miRNA biogenesis have been described, with a specific focus on guanosine-rich precursors that can form RNA G-quadruplex (rG4) structures. In this study, we show that several miRNA precursors, dysregulated upon APE1-depletion, contain an rG4 motif and that their corresponding target genes are upregulated after APE1-depletion. We also show, both by in vitro assays and by using a HeLa cell model, that APE1 can bind and regulate the folding of an rG4 structure contained in pre-miR92b, with a mechanism strictly dependent on critical lysine residues present in the N-terminal disordered region. Furthermore, APE1 depletion in HeLa cells alters the maturation process of miR-92b, mainly affecting the shuttling between the nucleus and cytosol. Lastly, bioinformatic analysis of APE1-regulated rG4-containing miRNAs supports the relevance of our findings for cancer biology. Specifically, these miRNAs exhibit high prognostic significance in lung, cervical, and liver cancer, as suggested by their involvement in several cancer-related pathways. Significance Statement We highlight an undescribed non-canonical role of the mammalian Apurinic/Apyrimidinic Endodeoxyribonuclease 1 (APE1) in the context of RNA G-quadruplexes (rG4), specifically in the alternative pathway of miRNA maturation of guanosine-rich miRNA precursors. Specifically, APE1 binds these structures and modulates their folding, mainly through its N-terminal region and some residues in its catalytic domain. Moreover, we showed an interesting new role of APE1 in regulating the shuttling and accumulation of miR-92b between the nuclear and cytosolic compartments, opening new perspectives on how APE1 may exercise its role in the miRNA maturation pathway and function. Moreover, APE1-depleted dysregulated miRNAs with rG4 motifs in their precursors have significant prognostic value in lung, cervical, and liver tumors, suggesting potential targets for cancer therapy.

Whereas hydroxyl radical is commonly named as the Fenton product responsible for DNA and RNA damage in cells, here we demonstrate that the cellular reaction generates carbonate radical anion due to physiological levels of bicarbonate. Analysis of the metabolome, transcriptome and, in human cells, the nuclear genome shows a consistent buffering of H

Using bioinformatic analysis of published data, we identify in human mRNA that potential G-quadruplex forming sequences (PQSs) colocalize with the epitranscriptomic modifications N6-methyladenosine (m6A), pseudouridine (Ψ), and inosine (I). A deeper analysis of the colocalized m6A and PQSs found them intronic in pre-mRNA near 5′ and 3′ splice sites. The loop lengths and sequence context of the m6A-bearing PQSs found short loops most commonly comprised of A nucleotides. This observation is consistent with literature reports of intronic m6A found in SAG (S = C or G) consensus motifs that are also recognized by splicing factors. The localization of m6A and PQSs in pre-mRNA at intron splice junctions suggests that these features could be involved in alternative mRNA splicing. A similar analysis for PQSs around sites of Ψ installation or A-to-I editing in mRNA also found a colocalization; however, the frequency was less than that observed with m6A.

Abstract Escherichia coli possess the 16S and 23S rRNA strands that have 36 chemical modification sites with 17 different structures. Direct RNA nanopore sequencing using a protein nanopore sensor and helicase brake, which is also a sensor, was applied to the rRNAs. Nanopore current levels, base calling profile, and helicase dwell times for the modifications relative to non-modified synthetic rRNA controls found signatures for nearly all modifications. Signatures for clustered modifications were determined by selective sequencing of writer knock-out E. coli and sequencing of synthetic RNAs utilizing some custom-synthesized nucleotide triphosphates for their preparation. The knowledge of each modification’s signature, apart from 5-methylcytidine, was used to determine how metabolic and cold-shock stress impact rRNA modifications. Metabolic stress resulted in either no change or a decrease, and one site increased in modification occupancy, while cold-shock stress led to either no change or a decrease. In the 16S rRNA, there resides an m 4 C m modification at site 1402 that decreased with both stressors. Using helicase dwell time, it was determined that the N 4 methyl group is lost during both stressors, and the 2’-OMe group remained. In the ribosome, this modification stabilizes binding to the mRNA codon at the P-site resulting in increased translational fidelity that is lost during stress. The E. coli genome has seven rRNA operons ( rrn ), and earlier studies aligned the nanopore reads to a single operon ( rrnA ). Here, the reads were aligned to the seven operons to identify operon-specific changes in the 11 pseudouridines. This study demonstrates that direct sequencing for >16 different RNA modifications in a strand is achievable.

Abstract Nanopore devices can directly sequence RNA, and the method has the potential to determine locations of epitranscriptomic modifications that have grown in significance because of their roles in cell regulation and stress response. Pseudouridine (Ψ), the most common modification in RNA, was sequenced with a nanopore system using a protein sensor with a helicase brake in synthetic RNAs with 100% modification at 18 known human pseudouridinylation sites. The new signals were compared to native uridine (U) control strands to characterize base calling and associated errors as well as ion current and dwell time changes. The data point to strong sequence context effects in which Ψ can easily be detected in some contexts while in others Ψ yields signals similar to U that would be false negatives in an unknown sample. We identified that the passage of Ψ through the helicase brake slowed the translocation kinetics compared to U and showed a smaller sequence bias that could permit detection of this modification in RNA. The unique signals from Ψ relative to U are proposed to reflect the syn-anti conformational flexibility of Ψ not found in U, and the difference in π stacking between these bases. This observation permitted analysis of SARS-CoV-2 nanopore sequencing data to identify five conserved Ψ sites on the 3’ end of the viral sub-genomic RNAs, and other less conserved Ψ sites. Using the helicase as a sensor protein in nanopore sequencing experiments enables detection of this modification in a greater number of relevant sequence contexts. The data are discussed concerning their analytical and biological significance.

Reactive oxygen species (ROS) have emerged as important cellular signaling agents for survival. Herein, we demonstrate that ROS-mediated oxidation of DNA to yield 8-oxo-7,8-dihydroguanine (OG) in gene promoters is a signaling agent for gene activation. Enhanced gene expression occurs when OG is formed in guanine-rich, potential G-quadruplex sequences (PQS) in promoter coding strands to initiate base excision repair (BER) by 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) yielding an abasic site (AP). The AP enables melting of the duplex to unmask the PQS to adopt a G-quadruplex fold in which apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) binds, but inefficiently cleaves, the AP for activation of VEGF or NTHL1 genes. This concept allowed identification of 61 human DNA repair genes that might be activated by this mechanism. Identification of the oxidatively-modified DNA base OG as guiding protein activity on the genome and altering cellular phenotype ascribes an epigenetic role to OG.

Abstract Molecular details for DNA damage impact on the folding of potential G-quadruplex sequences (PQS) to non-canonical DNA structures that are involved in gene regulation are poorly understood. Here, the effects of DNA base damage and strand breaks on PQS folding kinetics were studied in the context of the VEGF promoter sequence embedded between two DNA duplex anchors, referred to as a duplex-G-quadruplex-duplex (DGD) motif. This DGD scaffold imposes constraints on the PQS folding process that more closely mimic those found in genomic DNA. Folding kinetics were monitored by circular dichroism (CD) to find folding half-lives ranging from 2 s to 12 min depending on the DNA damage type and sequence position. The presence of Mg 2+ ions and the G-quadruplex (G4)-binding protein APE1 facilitated the folding reactions. A strand break placing all four G runs required for G4 formation on one side of the break accelerated the folding rate by >150-fold compared to the undamaged sequence. Combined 1D 1 H-NMR and CD analyses confirmed that isothermal folding of the VEGF -DGD constructs yielded spectral signatures that suggest formation of G4 motifs, and demonstrated a folding dependency with the nature and location of DNA damage. Importantly, the PQS folding half-lives measured are relevant to replication, transcription, and DNA repair time frames. TOC Graphic