Abstract The clustering of L-type calcium channels in cardiac myocytes presents an important mechanism for functional regulation of calcium signaling. Here we applied targeted super-resolution imaging techniques for the study of atrial-specific Ca V 1.3 channel clusters in human iPSC-derived atrial cardiomyocytes (hiPSC-aCM). We thereby clarified cluster localization, dimensions, architecture, and dynamics, which were largely unexplored previously. Live-cell STimulated Emission Depletion (STED) imaging identified that cell surface-localized clusters contained 9 channel molecules within 120 nm diameter on average. DNA Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography (DNA-PAINT) optimized for molecular mapping revealed an irregular arrangement of channels with significant spacing. Single Particle Tracking (SPT) further evidenced that clustered channels do not associate into rigidly packed structures (oligomers or lattices), but rather co-diffuse in confined and stationary membrane nanodomains. Immunofluorescence showed consistent cell-surface colocalization with Ryanodine Receptor type 2 and Junctophilin-2 forming stable calcium release units, similar to dyadic junctions containing Ca V 1.2 in ventricular cardiomyocytes. Lastly, novel genetic constructs for live-cell imaging showed that the cytosolic C-terminal tail of Ca V 1.3 by itself is sufficient for cluster formation. In conclusion, a novel strategy for LTCC clustering studies in atrial cells was established, suitable for a wide range of super-resolution imaging techniques. Based on live-cell STED, DNA-PAINT and SPT data, we propose that Ca V 1.3 channel clusters consist of mobile individual channels inside defined membrane nanodomains.

ABSTRACT DNA-points accumulation for imaging in nanoscale topography (DNA-PAINT) is a potent variant of single-molecule localization microscopy (SMLM) which is highly effective for multiplexed super-resolution imaging. It achieves localization precision down to nanometers in the lateral direction. However, its routine axial localization precision is approximately three-fold lower as compared to the lateral localization precision. Recently, a technique known as Metal-Induced Energy Transfer (MIET) has been introduced, offering excellent axial resolution at the nanometer scale up to 200 nm above a surface. MIET is characterized by a low entry barrier, as its sole technical requirement is the availability of a fluorescence lifetime imaging modality. In this study, we harness the synergy between the exceptional axial resolution provided by MIET and the lateral resolution achieved with DNA-PAINT (MIET-PAINT) to accomplish multitarget 3D super-resolution imaging. We implemented MIET-PAINT using a wide-field fluorescence lifetime imaging microscope. We validated our technique by measuring the height of emitters placed on top of spacers of known thicknesses. We then demonstrated multiplexed MIET-PAINT imaging of fixed cells to visualize mechanotransduction proteins in the focal adhesion complex (FAC) and the cytoskeleton. We explored the structural arrangement of paxillin, zyxin, and actin stress fibers in U2OS cells and discovered that MIET-PAINT can reliably address multiple targets, providing lateral and axial nanometerscale resolution.