While significant progress has been made in understanding the molecular events underlying the early specification of the antero-posterior and dorso-ventral axes, little information is available regarding the cellular or molecular basis for left-right (LR) differences in animal morphogenesis. We describe the expression patterns of three genes involved in LR determination in chick embryos: activin receptor IIa, Sonic hedgehog (Shh), and cNR-1 (related to the mouse gene nodal). These genes are expressed asymmetrically during and after gastrulation and regulate the expression of one another in a sequential pathway. Moreover, manipulation of the sidedness of either activin protein or Shh expression alters heart situs. Together, these observations identify a cascade of molecular asymmetry in that determines morphological LR asymmetry in the chick embryo.

A pharmacological screen identified the H+ and K+ ATPase transporter as obligatory for normal orientation of the left-right body axis in Xenopus. Maternal H+/K+-ATPase mRNA is symmetrically expressed in the 1-cell Xenopus embryo but becomes localized during the first two cell divisions, demonstrating that asymmetry is generated within two hours postfertilization. Although H+/K+-ATPase subunit mRNAs are symmetrically localized in chick embryos, an endogenous H+/K+-ATPase-dependent difference in membrane voltage potential exists between the left and right sides of the primitive streak. In both species, pharmacologic or genetic perturbation of endogenous H+/K+-ATPase randomized the sided pattern of asymmetrically expressed genes and induced organ heterotaxia. Thus, LR asymmetry determination depends on a very early differential ion flux created by H+/K+-ATPase activity.

Living systems are more robust, diverse, complex, and supportive of human life than any technology yet created. However, our ability to create novel lifeforms is currently limited to varying existing organisms or bioengineering organoids in vitro. Here we show a scalable pipeline for creating functional novel lifeforms: AI methods automatically design diverse candidate lifeforms in silico to perform some desired function, and transferable designs are then created using a cell-based construction toolkit to realize living systems with the predicted behaviors. Although some steps in this pipeline still require manual intervention, complete automation in future would pave the way to designing and deploying unique, bespoke living systems for a wide range of functions.

In addition to biochemical gradients and transcriptional networks, cell behavior is regulated by endogenous bioelectrical cues originating in the activity of ion channels and pumps, operating in a wide variety of cell types. Instructive signals mediated by changes in resting potential control proliferation, differentiation, cell shape, and apoptosis of stem, progenitor, and somatic cells. Of importance, however, cells are regulated not only by their own Vmem but also by the Vmem of their neighbors, forming networks via electrical synapses known as gap junctions. Spatiotemporal changes in Vmem distribution among nonneural somatic tissues regulate pattern formation and serve as signals that trigger limb regeneration, induce eye formation, set polarity of whole-body anatomical axes, and orchestrate craniofacial patterning. New tools for tracking and functionally altering Vmem gradients in vivo have identified novel roles for bioelectrical signaling and revealed the molecular pathways by which Vmem changes are transduced into cascades of downstream gene expression. Because channels and gap junctions are gated posttranslationally, bioelectrical networks have their own characteristic dynamics that do not reduce to molecular profiling of channel expression (although they couple functionally to transcriptional networks). The recent data provide an exciting opportunity to crack the bioelectric code, and learn to program cellular activity at the level of organs, not only cell types. The understanding of how patterning information is encoded in bioelectrical networks, which may require concepts from computational neuroscience, will have transformative implications for embryogenesis, regeneration, cancer, and synthetic bioengineering.

Understanding how organisms establish their form during embryogenesis and regeneration represents a major knowledge gap in biological pattern formation. It has been recently suggested that morphogenesis could be understood in terms of cellular information processing and the ability of cell groups to model shape. Here, we offer a proof of principle that self-assembly is an emergent property of cells that share a common (genetic and epigenetic) model of organismal form. This behaviour is formulated in terms of variational free-energy minimization-of the sort that has been used to explain action and perception in neuroscience. In brief, casting the minimization of thermodynamic free energy in terms of variational free energy allows one to interpret (the dynamics of) a system as inferring the causes of its inputs-and acting to resolve uncertainty about those causes. This novel perspective on the coordination of migration and differentiation of cells suggests an interpretation of genetic codes as parametrizing a generative model-predicting the signals sensed by cells in the target morphology-and epigenetic processes as the subsequent inversion of that model. This theoretical formulation may complement bottom-up strategies-that currently focus on molecular pathways-with (constructivist) top-down approaches that have proved themselves in neuroscience and cybernetics.

All epistemic agents physically consist of parts that must somehow comprise an integrated cognitive self. Biological individuals consist of subunits (organs, cells, and molecular networks) that are themselves complex and competent in their own native contexts. How do coherent biological Individuals result from the activity of smaller sub-agents? To understand the evolution and function of metazoan creatures' bodies and minds, it is essential to conceptually explore the origin of multicellularity and the scaling of the basal cognition of individual cells into a coherent larger organism. In this article, I synthesize ideas in cognitive science, evolutionary biology, and developmental physiology toward a hypothesis about the origin of Individuality: "Scale-Free Cognition." I propose a fundamental definition of an Individual based on the ability to pursue goals at an appropriate level of scale and organization and suggest a formalism for defining and comparing the cognitive capacities of highly diverse types of agents. Any Self is demarcated by a computational surface - the spatio-temporal boundary of events that it can measure, model, and try to affect. This surface sets a functional boundary - a cognitive "light cone" which defines the scale and limits of its cognition. I hypothesize that higher level goal-directed activity and agency, resulting in larger cognitive boundaries, evolve from the primal homeostatic drive of living things to reduce stress - the difference between current conditions and life-optimal conditions. The mechanisms of developmental bioelectricity - the ability of all cells to form electrical networks that process information - suggest a plausible set of gradual evolutionary steps that naturally lead from physiological homeostasis in single cells to memory, prediction, and ultimately complex cognitive agents, via scale-up of the basic drive of infotaxis. Recent data on the molecular mechanisms of pre-neural bioelectricity suggest a model of how increasingly sophisticated cognitive functions emerge smoothly from cell-cell communication used to guide embryogenesis and regeneration. This set of hypotheses provides a novel perspective on numerous phenomena, such as cancer, and makes several unique, testable predictions for interdisciplinary research that have implications not only for evolutionary developmental biology but also for biomedicine and perhaps artificial intelligence and exobiology.

Limb regeneration is a frontier in biomedical science. Identifying triggers of innate morphogenetic responses in vivo to induce the growth of healthy patterned tissue would address the needs of millions of patients, from diabetics to victims of trauma. Organisms such as Xenopus laevis-whose limited regenerative capacities in adulthood mirror those of humans-are important models with which to test interventions that can restore form and function. Here, we demonstrate long-term (18 months) regrowth, marked tissue repatterning, and functional restoration of an amputated X. laevis hindlimb following a 24-hour exposure to a multidrug, pro-regenerative treatment delivered by a wearable bioreactor. Regenerated tissues composed of skin, bone, vasculature, and nerves significantly exceeded the complexity and sensorimotor capacities of untreated and control animals' hypomorphic spikes. RNA sequencing of early tissue buds revealed activation of developmental pathways such as Wnt/β-catenin, TGF-β, hedgehog, and Notch. These data demonstrate the successful "kickstarting" of endogenous regenerative pathways in a vertebrate model.

ABSTRACT Many neurodevelopmental genetic disorders, such as Rett syndrome, are caused by a single gene mutation but trigger changes in expression and regulation of numerous other genes. This severely impair functions of multiple organs and organ systems beyond the central nervous system (CNS), adding to the challenge of developing broadly effective treatments based on a single drug target. This challenge is further complicated by the lack of sufficiently broad and biologically relevant drug screens, and the inherent complexity in identifying clinically relevant targets responsible for diverse phenotypes. Here, we combined human gene regulatory network-based computational drug prediction with in vivo screening in a population-level diversity, CRISPR-edited, Xenopus laevis tadpole model of Rett syndrome to carry out target-agnostic drug discovery, which rapidly led to the identification of the FDA-approved drug vorinostat as a potential repurposing candidate. Vorinostat broadly improved both CNS and non-CNS (e.g., gastrointestinal, respiratory, inflammatory) abnormalities in a pre-clinical mouse model of Rett syndrome. This is the first Rett syndrome treatment to demonstrate pre-clinical efficacy across multiple organ systems when dosed after the onset of symptoms, and network analysis revealed a putative therapeutic mechanism for its cross-organ normalizing effects based on its impact on acetylation metabolism and post-translational modifications of microtubules. Although traditionally considered an inhibitor of histone deacetylases (HDAC), vorinostat unexpectedly restored protein acetylation across both hypo- and hyperacetylated tissues, suggesting non-HDAC-mediated therapeutic mechanisms supported by proteomic analysis.

Abstract Fundamental knowledge gaps exist with respect to the plasticity of cells from adult soma and the potential diversity of body shape and behavior in living constructs derived from such genetically wild-type cells. Here we introduce Anthrobots, a spheroid-shaped multicellular biological robot (biobot) platform with diameters ranging from 30 to 500 microns. Anthrobots have an inherent capacity for motility in aqueous environments, via cilia covering their surface. Each Anthrobot starts out as a single cell, derived from the adult human lung, and self-constructs into a multicellular motile biobot after having been cultured in extra cellular matrix for 2 weeks and transferred into a minimally viscous habitat. Anthrobots exhibit a wide range of behaviors with motility patterns ranging from tight loops to straight lines and speeds ranging from 5-50 microns/second. Our anatomical investigations reveal that this behavioral diversity is significantly correlated with their morphological diversity. Anthrobots can assume diverse morphologies from fully polarized to wholly ciliated bodies with spherical or ellipsoidal shapes, each correlating with a distinct movement type. Remarkably, as a function of these different movement types, Anthrobots were found to be capable of traversing live human tissues in various ways. Furthermore, Anthrobots were able to induce rapid repair of wounds in human neural cell sheets in vitro. By controlling microenvironmental cues in bulk, entirely novel structure, behavior, and biomedically-relevant capabilities can be discovered in morphogenetic processes without direct genetic editing or manual sculpting. Significance Statement We demonstrate that normal, non-genetically-modified human tracheal cells can be induced to form a new proto-organism - Anthrobots - which exhibit spontaneous behavior, swimming around in one of several patterns, demonstrating plasticity for novel form and function inherent in even elderly human somatic cells. Moreover, Anthrobots are able to traverse over cultured neurons, settling down and causing repair under them: the nerves knit together across the wound gap due to the presence of the Anthrobot. A patient’s own cells can be harnessed to make a motile biological robot that can traverse human tissue and induce repair. In the future, this platform can deliver pro-regenerative therapeutics for a range of biomedical applications that will not trigger rejection or require immune suppression.

Abstract The internal workings of biological systems are notoriously difficult to understand. Due to the prevalence of noise and degeneracy in evolved systems, in many cases the workings of everything from gene regulatory networks to protein-protein interactome networks remain black boxes. One consequence of this black-box nature is that it is unclear at which scale to analyze biological systems to best understand their function. We analyzed the protein interactomes of over 1800 species, containing in total 8,782,166 protein-protein interactions, at different scales. We demonstrate the emergence of higher order ‘macroscales’ in these interactomes and that these biological macroscales are associated with lower noise and degeneracy and therefore lower uncertainty. Moreover, the nodes in the interactomes that make up the macroscale are more resilient compared to nodes that do not participate in the macroscale. These effects are more pronounced in interactomes of Eukaryota, as compared to Prokaryota. This points to plausible evolutionary adaptation for macroscales: biological networks evolve informative macroscales to gain benefits of both being uncertain at lower scales to boost their resilience, and also being ‘certain’ at higher scales to increase their effectiveness at information transmission. Our work explains some of the difficulty in understanding the workings of biological networks, since they are often most informative at a hidden higher scale, and demonstrates the tools to make these informative higher scales explicit.