The highly lethal brain cancer glioblastoma (GBM) poses a daunting challenge because the blood-brain barrier renders potentially druggable amplified or mutated oncoproteins relatively inaccessible. Here, we identify sphingomyelin phosphodiesterase 1 (SMPD1), an enzyme that regulates the conversion of sphingomyelin to ceramide, as an actionable drug target in GBM. We show that the highly brain-penetrant antidepressant fluoxetine potently inhibits SMPD1 activity, killing GBMs, through inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling and via activation of lysosomal stress. Combining fluoxetine with temozolomide, a standard of care for GBM, causes massive increases in GBM cell death and complete tumor regression in mice. Incorporation of real-world evidence from electronic medical records from insurance databases reveals significantly increased survival in GBM patients treated with fluoxetine, which was not seen in patients treated with other selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) antidepressants. These results nominate the repurposing of fluoxetine as a potentially safe and promising therapy for patients with GBM and suggest prospective randomized clinical trials.

ABSTRACT Chemical probes are lacking for most human proteins. Covalent chemistry represents an attractive strategy for expanding the ligandability of the proteome, and chemical proteomics has revealed numerous electrophile-reactive cysteines on diverse proteins. Determining which of these covalent binding events impact protein function, however, remains challenging. Here, we describe a base-editing strategy to infer the functionality of cysteines by quantifying the impact of their missense mutation on cell proliferation. We show that the resulting atlas, which covers >13,800 cysteines on >1,750 cancer dependency proteins, correctly predicts the essentiality of cysteines targeted by cancer therapeutics and, when integrated with chemical proteomic data, identifies essential, ligandable cysteines on >110 cancer dependency proteins. We further demonstrate how measurements of reactivity in native versus denatured proteomes can discriminate essential cysteines amenable to chemical modification from those buried in protein structures, providing a valuable resource to prioritize the pursuit of small-molecule probes with high function-perturbing potential.

Abstract Transcriptional co-regulators, which mediate chromatin-dependent transcriptional signaling, represent tractable targets to modulate tumorigenic gene expression programs with small molecules. Genetic loss-of-function studies have recently implicated the transcriptional co-activator, ENL, as a selective requirement for the survival of acute leukemia and highlighted an essential role for its chromatin reader YEATS domain. Motivated by these discoveries, we executed a screen of nearly 300,000 small molecules and identified an amido-imidazopyridine inhibitor of the ENL YEATS domain (IC 50 = 7 µM). Leveraging a SuFEx-based high-throughput approach to medicinal chemistry optimization, we discovered SR-0813 (IC 50 = 25 nM), a potent and selective ENL/AF9 YEATS domain inhibitor that exclusively inhibits the growth of ENL-dependent leukemia cell lines. Armed with this tool and a first-in-class ENL PROTAC, SR-1114, we detailed the response of AML cells to pharmacological ENL disruption for the first time. Most notably, displacement of ENL from chromatin by SR-0813 elicited a strikingly selective suppression of ENL target genes, including HOXA9/10, MYB, MYC and a number of other leukemia proto-oncogenes. Our study reproduces a number of key observations previously made by CRISPR/Cas9 loss of function and dTAG-mediated degradation, and therefore, both reinforces ENL as an emerging leukemia target and validates SR-0813 as a high-quality chemical probe.

Summary Most human proteins lack chemical probes, and several large-scale and generalizable small-molecule binding assays have been introduced to address this problem. How compounds discovered in such “binding-first” assays affect protein function, nonetheless, often remains unclear. Here, we describe a “function-first” proteomic strategy that uses size exclusion chromatography (SEC) to assess the global impact of electrophilic compounds on protein complexes in human cells. Integrating the SEC data with cysteine-directed activity-based protein profiling identifies changes in protein-protein interactions that are caused by site-specific liganding events, including the stereoselective engagement of cysteines in PSME1 and SF3B1 that disrupt the PA28 proteasome regulatory complex and stabilize a dynamic state of the spliceosome, respectively. Our findings thus show how multidimensional proteomic analysis of focused libraries of electrophilic compounds can expedite the discovery of chemical probes with site-specific functional effects on protein complexes in human cells.

Abstract Ferroptosis is an iron-dependent form of cell death driven by the oxidation of polyunsaturated (PUFA) phospholipids. Large-scale genetic screens have pointed to a specialized role for PUFA ether phospholipids (ePLs) in promoting ferroptosis. Our understanding of the enzymes involved in PUFA ePL production, however, remains incomplete. Here we show using a combination of pathway mining of genetic dependency maps, AlphaFold-guided structure predictions, and targeted lipidomics that the uncharacterized transmembrane protein TMEM164 – genetic ablation of which has been shown to protect cells from ferroptosis – is a cysteine active-center enzyme that selectively transfers C20:4 acyl chains from phosphatidylcholine to lyso-ePLs to furnish PUFA-ePLs. TMEM164-null cells show substantial reductions in PUFA-ePLs, but not PUFA ester phospholipids, supporting that the selective suppression of PUFA-ePLs is sufficient to protect cells from ferroptosis and designating TMEM164 as a key enzyme specifically responsible for regulating this class of lipids.

Abstract The anti-viral and anti-cancer STING innate immune pathway can exacerbate autoimmune and neurodegenerative diseases when aberrantly activated, emphasizing a key unmet need for STING pathway antagonists. However, no such inhibitors have advanced to the clinic because it remains unclear which mechanistic step(s) of human STING activation are crucial for potent and context-independent inhibition of downstream signaling. Here, we report that C91 palmitoylation, the mechanistic target of a potent tool compound, is not universally necessary for human STING signaling, making it a poor target for drug development. Instead, we discover that evolutionarily conserved C64 is basally palmitoylated and is crucial for preventing unproductive STING oligomerization in the absence of cGAMP stimulation. The effects of palmitoylation at C64 and C91 converge on the control of intra-dimer disulfide bond formation at C148. Importantly, we show for the first time that signaling-competent STING oligomers are composed of a mixture of two species: disulfide-linked STING dimers that stabilize the oligomer, and reduced STING dimers that are phosphorylated to actuate interferon signaling. Given this complex landscape and cell type specificity of palmitoylation modifications, we conclude that robust STING inhibitors must directly inhibit the oligomerization process. Taking inspiration from STING’s natural autoinhibitory mechanism, we identified an eight amino acid peptide that binds a defined pocket at the inter-dimer oligomerization interface as a proof-of-concept human STING inhibitor, setting the stage for future therapeutic development. Summary We report that functional STING oligomers require palmitoylation at cysteine 64 and some proportion of reduced dimers, and define the site of autoinhibition that can be targeted to disrupt STING oligomerization and activity.

Abstract Histone deacetylases (HDACs) have been widely pursued as targets for anti-cancer therapeutics. However, many of these targets are universally essential for cell survival, which may limit the therapeutic window that can be achieved by drug candidates. By examining large collections of CRISPR/Cas9-based essentiality screens, we discovered a genetic interaction between HDAC1 and HDAC2 wherein each paralog is synthetically lethal with hemizygous deletion of the other. This collateral synthetic lethality is caused by recurrent chromosomal translocations that occur in diverse solid and hematological malignancies, including neuroblastoma and multiple myeloma. Using genetic deletion or dTAG-mediated degradation, we show that HDAC2 disruption suppresses the growth of HDAC1 -deficient neuroblastoma in vitro and in vivo. Mechanistically, we find that targeted degradation of HDAC2 in these cells prompts the degradation of several members of the nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) complex, leading to diminished chromatin accessibility at HDAC2/NuRD-bound sites of the genome and impaired control of enhancer-associated transcription. Furthermore, we reveal that several of the degraded NuRD complex subunits are dependencies in neuroblastoma and multiple myeloma, providing motivation to develop paralog-selective HDAC1 or HDAC2 degraders. Altogether, we identify HDAC1/2 collateral synthetic lethality as a new therapeutic target and reveal a novel mechanism for exploiting NuRD-associated cancer dependencies.

Chemical proteomics enables the global assessment of small molecule-protein interactions in native biological systems and has emerged as a versatile approach for ligand discovery. The range of small molecules explored by chemical proteomics has, however, been limited. Here, we describe a diversity-oriented synthesis (DOS)-inspired library of stereochemically-defined compounds bearing diazirine and alkyne units for UV light-induced covalent modification and click chemistry enrichment of interacting proteins, respectively. We find that these 'photo-stereoprobes' interact in a stereoselective manner with hundreds of proteins from various structural and functional classes in human cells and demonstrate that these interactions can form the basis for high-throughput screening-compatible nanoBRET assays. Integrated phenotypic analysis and chemical proteomics identified photo-stereoprobes that modulate autophagy by engaging the mitochondrial serine protease CLPP. Our findings show the utility of photo-stereoprobes for expanding the ligandable proteome, furnishing target engagement assays, and discovering and characterizing bioactive small molecules by cell-based screening.

Cells rely on antioxidants to survive. The most abundant antioxidant is glutathione (GSH). The synthesis of GSH is non-redundantly controlled by the glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC). GSH imbalance is implicated in many diseases, but the requirement for GSH in adult tissues is unclear. To interrogate this, we developed a series of in vivo models to induce Gclc deletion in adult animals. We find that GSH is essential to lipid abundance in vivo. GSH levels are reported to be highest in liver tissue, which is also a hub for lipid production. While the loss of GSH did not cause liver failure, it decreased lipogenic enzyme expression, circulating triglyceride levels, and fat stores. Mechanistically, we found that GSH promotes lipid abundance by repressing NRF2, a transcription factor induced by oxidative stress. These studies identify GSH as a fulcrum in the liver's balance of redox buffering and triglyceride production.

Summary Despite significant interest in therapeutic targeting of splicing, few chemical probes are available for the proteins involved in splicing. Here, we show that elaborated stereoisomeric acrylamide chemical probe EV96 and its analogues lead to a selective T cell state-dependent loss of interleukin 2-inducible T cell kinase (ITK) by targeting one of the core splicing factors SF3B1. Mechanistic investigations suggest that the state-dependency stems from a combination of differential protein turnover rates and availability of functional mRNA pools that can be depleted due to extensive alternative splicing. We further introduce a comprehensive list of proteins involved in splicing and leverage both cysteine- and protein-directed activity-based protein profiling (ABPP) data with electrophilic scout fragments to demonstrate covalent ligandability for many classes of splicing factors and splicing regulators in primary human T cells. Taken together, our findings show how chemical perturbation of splicing can lead to immune state-dependent changes in protein expression and provide evidence for the broad potential to target splicing factors with covalent chemistry.