The role of mitochondria in cell metabolism and survival is controlled by calcium signals that are commonly transmitted at the close associations between mitochondria and endoplasmic reticulum (ER). However, the physical linkage of the ER-mitochondria interface and its relevance for cell function remains elusive. We show by electron tomography that ER and mitochondria are adjoined by tethers that are approximately 10 nm at the smooth ER and approximately 25 nm at the rough ER. Limited proteolysis separates ER from mitochondria, whereas expression of a short "synthetic linker" (<5 nm) leads to tightening of the associations. Although normal connections are necessary and sufficient for proper propagation of ER-derived calcium signals to the mitochondria, tightened connections, synthetic or naturally observed under apoptosis-inducing conditions, make mitochondria prone to Ca2+ overloading and ensuing permeability transition. These results reveal an unexpected dependence of cell function and survival on the maintenance of proper spacing between the ER and mitochondria.

The voltage-dependent anion channel (VDAC) of the outer mitochondrial membrane mediates metabolic flow, Ca(2+), and cell death signaling between the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondrial networks. We demonstrate that VDAC1 is physically linked to the endoplasmic reticulum Ca(2+)-release channel inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP(3)R) through the molecular chaperone glucose-regulated protein 75 (grp75). Functional interaction between the channels was shown by the recombinant expression of the ligand-binding domain of the IP(3)R on the ER or mitochondrial surface, which directly enhanced Ca(2+) accumulation in mitochondria. Knockdown of grp75 abolished the stimulatory effect, highlighting chaperone-mediated conformational coupling between the IP(3)R and the mitochondrial Ca(2+) uptake machinery. Because organelle Ca(2+) homeostasis influences fundamentally cellular functions and death signaling, the central location of grp75 may represent an important control point of cell fate and pathogenesis.

Phosphoinositide 3-kinases (PI3-Ks) are an important emerging class of drug targets, but the unique roles of PI3-K isoforms remain poorly defined. We describe here an approach to pharmacologically interrogate the PI3-K family. A chemically diverse panel of PI3-K inhibitors was synthesized, and their target selectivity was biochemically enumerated, revealing cryptic homologies across targets and chemotypes. Crystal structures of three inhibitors bound to p110γ identify a conformationally mobile region that is uniquely exploited by selective compounds. This chemical array was then used to define the PI3-K isoforms required for insulin signaling. We find that p110α is the primary insulin-responsive PI3-K in cultured cells, whereas p110β is dispensable but sets a phenotypic threshold for p110α activity. Compounds targeting p110α block the acute effects of insulin treatment in vivo, whereas a p110β inhibitor has no effect. These results illustrate systematic target validation using a matrix of inhibitors that span a protein family.

Morphologic polarity is necessary for chemotaxis of mammalian cells. As a probe of intracellular signals responsible for this asymmetry, the pleckstrin homology domain of the AKT protein kinase (or protein kinase B), tagged with the green fluorescent protein (PHAKT-GFP), was expressed in neutrophils. Upon exposure of cells to chemoattractant, PHAKT-GFP is recruited selectively to membrane at the cell's leading edge, indicating an internal signaling gradient that is much steeper than that of the chemoattractant. Translocation of PHAKT-GFP is inhibited by toxin-B from Clostridium difficile, indicating that it requires activity of one or more Rho guanosine triphosphatases.

Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns[4,5]P2) pools that bind pleckstrin homology (PH) domains were visualized by cellular expression of a phospholipase C (PLC)delta PH domain-green fluorescent protein fusion construct and analysis of confocal images in living cells. Plasma membrane localization of the fluorescent probe required the presence of three basic residues within the PLCdelta PH domain known to form critical contacts with PtdIns(4, 5)P2. Activation of endogenous PLCs by ionophores or by receptor stimulation produced rapid redistribution of the fluorescent signal from the membrane to cytosol, which was reversed after Ca2+ chelation. In both ionomycin- and agonist-stimulated cells, fluorescent probe distribution closely correlated with changes in absolute mass of PtdIns(4,5)P2. Inhibition of PtdIns(4,5)P2 synthesis by quercetin or phenylarsine oxide prevented the relocalization of the fluorescent probe to the membranes after Ca2+ chelation in ionomycin-treated cells or during agonist stimulation. In contrast, the synthesis of the PtdIns(4,5)P2 imaged by the PH domain was not sensitive to concentrations of wortmannin that had been found inhibitory of the synthesis of myo-[3H]inositol- labeled PtdIns(4,5)P2. Identification and dynamic imaging of phosphoinositides that interact with PH domains will further our understanding of the regulation of such proteins by inositol phospholipids.

The ER-mitochondrial junction provides a local calcium signaling domain that is critical for both matching energy production with demand and the control of apoptosis. Here, we visualize ER-mitochondrial contact sites and monitor the localized [Ca(2+)] changes ([Ca(2+)](ER-mt)) using drug-inducible fluorescent interorganelle linkers. We show that all mitochondria have contacts with the ER, but plasma membrane (PM)-mitochondrial contacts are less frequent because of interleaving ER stacks in both RBL-2H3 and H9c2 cells. Single mitochondria display discrete patches of ER contacts and show heterogeneity in the ER-mitochondrial Ca(2+) transfer. Pericam-tagged linkers revealed IP(3)-induced [Ca(2+)](ER-mt) signals that exceeded 9 microM and endured buffering bulk cytoplasmic [Ca(2+)] increases. Altering linker length to modify the space available for the Ca(2+) transfer machinery had a biphasic effect on [Ca(2+)](ER-mt) signals. These studies provide direct evidence for the existence of high-Ca(2+) microdomains between the ER and mitochondria and suggest an optimal gap width for efficient Ca(2+) transfer.

Many RNA viruses remodel intracellular membranes to generate specialized sites for RNA replication. How membranes are remodeled and what properties make them conducive for replication are unknown. Here we show how RNA viruses can manipulate multiple components of the cellular secretory pathway to generate organelles specialized for replication that are distinct in protein and lipid composition from the host cell. Specific viral proteins modulate effector recruitment by Arf1 GTPase and its guanine nucleotide exchange factor GBF1, promoting preferential recruitment of phosphatidylinositol-4-kinase IIIbeta (PI4KIIIbeta) to membranes over coat proteins, yielding uncoated phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) lipid-enriched organelles. The PI4P-rich lipid microenvironment is essential for both enteroviral and flaviviral RNA replication; PI4KIIIbeta inhibition interferes with this process; and enteroviral RNA polymerases specifically bind PI4P. These findings reveal how RNA viruses can selectively exploit specific elements of the host to form specialized organelles where cellular phosphoinositide lipids are key to regulating viral RNA replication.

Hepatitis C virus (HCV) is a major causative agent of chronic liver disease in humans. To gain insight into host factor requirements for HCV replication, we performed a siRNA screen of the human kinome and identified 13 different kinases, including phosphatidylinositol-4 kinase III alpha (PI4KIIIα), as being required for HCV replication. Consistent with elevated levels of the PI4KIIIα product phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) detected in HCV-infected cultured hepatocytes and liver tissue from chronic hepatitis C patients, the enzymatic activity of PI4KIIIα was critical for HCV replication. Viral nonstructural protein 5A (NS5A) was found to interact with PI4KIIIα and stimulate its kinase activity. The absence of PI4KIIIα activity induced a dramatic change in the ultrastructural morphology of the membranous HCV replication complex. Our analysis suggests that the direct activation of a lipid kinase by HCV NS5A contributes critically to the integrity of the membranous viral replication complex.

Phosphoinositide Contributions To study the roles of phosphoinositides in the plasma membrane of mammalian cells, Hammond et al. (p. 727 , published online 21 June; see the Perspective by Fairn and Grinstein ) engineered phosphatase molecules that could be targeted to the membrane on demand, where they would alter the concentrations of the phospholipids phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate [PI(4,5)P 2 ] and phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P). PI4P was thought to provide a major source for the synthesis of PI(4,5)P 2 , but depletion of PI4P did not have much affect on synthesis of PI(4,5)P 2 . Instead, PI4P appears to help to establish the negative charge at the membrane and thus promote electrostatic interactions with positively charged amino acids in membrane-associated proteins and influencing function of ion channels.

ADP-ribosylation factor (Arf) 6 regulates the movement of membrane between the plasma membrane (PM) and a nonclathrin-derived endosomal compartment and activates phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase (PIP 5-kinase), an enzyme that generates phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Here, we show that PIP2 visualized by expressing a fusion protein of the pleckstrin homology domain from PLCδ and green fluorescent protein (PH-GFP), colocalized with Arf6 at the PM and on tubular endosomal structures. Activation of Arf6 by expression of its exchange factor EFA6 stimulated protrusion formation, the uptake of PM into macropinosomes enriched in PIP2, and recycling of this membrane back to the PM. By contrast, expression of Arf6 Q67L, a GTP hydrolysis-resistant mutant, induced the formation of PIP2-positive actin-coated vacuoles that were unable to recycle membrane back to the PM. PM proteins, such as β1-integrin, plakoglobin, and major histocompatibility complex class I, that normally traffic through the Arf6 endosomal compartment became trapped in this vacuolar compartment. Overexpression of human PIP 5-kinase α mimicked the effects seen with Arf6 Q67L. These results demonstrate that PIP 5-kinase activity and PIP2 turnover controlled by activation and inactivation of Arf6 is critical for trafficking through the Arf6 PM-endosomal recycling pathway.