ABSTRACT The screening of new anti-mycobacterial chemicals is primarily focused on inhibiting the active growing bacteria. However, a major challenge in tuberculosis control is the ability of Mycobacterium tuberculosis to enter a nonreplicating state for extended periods, rendering it resistant to many clinical drugs and complicating eradication efforts. Existing low-oxygen-recovery assays designed for screening compounds targeting nonreplicating M. tuberculosis have limitations, including the colony-forming unit counting for non-luminous M. tuberculosis and the instability of the free plasmid carrying luxAB genes in luminescent M. tuberculosis , along with exogenous substrate requirements for light producing. Moreover, these assays fail to accurately replicate the growth conditions of nonreplicating M. tuberculosis in vitro , thus resulting in less convincing results. To address these challenges, we have developed an autoluminescence-based, cholesterol-enriched culture evaluation model to assess 17 anti-tuberculosis drugs of different classes against nonreplicating M. tuberculosis . Our findings indicate that the relative light unit, measured in real-time, serves as a reliable surrogate marker for colony-forming unit, which typically becomes available one month later. This suggests the utility of our model for the rapid determination of drug susceptibility dynamically. The autoluminescent M. tuberculosis , harbouring luxCDABE gene cluster within its genome, can emit blue-green light stably and autonomously without requiring an external substrate supplement. The minimal inhibitory concentrations of all the drugs tested under anaerobic conditions are significantly different from that detected in aerobic environment. Our model allows for rapid, precise, and efficient assessment of drug activity under anaerobic conditions, thereby enabling a more comprehensive evaluation of anti-mycobacterial efficacy. Overall, our model represents a significant advancement in anti-tuberculosis drug discovery and pharmaceutical development.

ABSTRACT Toxicity and inconvenience associated with the use of injectable drug-containing regimens for tuberculosis (TB) have made all-oral regimens a preferred alternative. Widespread resistance to fluoroquinolones and pyrazinamide makes it essential to identify new drug candidates and study their effects on current regimens for TB. TB47 is a pyrazolo[1,5-a]pyridine-3-carboxamide with powerful synergistic in vitro and in vivo activities against mycobacteria, especially with clofazimine. Here, we investigated the bactericidal and sterilizing activities of novel oral regimens containing TB47 + clofazimine + linezolid, and the potential roles of levofloxacin and/or pyrazinamide in such drug combinations. Using a well-established mouse model, we assessed the effect of these regimens on bacterial burden in the lung during treatment and relapse (4 months after stopping treatment + immunosuppression). Our findings indicate that the TB47 + clofazimine + linezolid + pyrazinamide, with/without levofloxacin, regimens had fast-acting (4 months) sterilizing activity and no relapse was observed. When pyrazinamide was excluded from the regimen, treatment times were longer (5-6 months) to achieve sterilizing conditions. We propose that TB47 + clofazimine + linezolid can form a highly sterilizing block for use as an alternative pan-TB regimen.

ABSTRACT Mycobacterium abscessus (Mab) poses serious therapeutic challenges, principally due to its intrinsic resistance to a wide array of antibiotics. The pressing issue of drug resistance has spurred an urgent need to explore novel targets and develop new therapeutic agents against Mab. The MtrAB two-component system, conserved among Actinobacteria, is pivotal for regulating various metabolic processes. Nevertheless, the role of MtrAB in Mab remains elusive. In this study, we uncovered that Mab strains with disrupted mtrA, mtrB or both exhibited heightened susceptibility to a variety of antibiotics with diverse mechanisms of action, in contrast to the wild-type strain. In a murine model, rifabutin, bedaquiline, and amikacin, which were inactive against the wild-type Mab strain, demonstrated efficacy against all the mtrA, mtrB and mtrAB knockout strains, significantly reducing pulmonary bacterial burdens compared to vehicle controls after ten days of treatment. Notably, the virulence of all the mtrA, mtrB , and mtrAB knockout strains was highly diminished in the murine model, as evidenced by a substantial decrease in bacterial load in the lungs of mice after 16 days. We observed that all three knockout strains exhibited a significantly reduced growth rate compared to the wild-type strain. We discovered that cells lacking mtrA, mtrB or both exhibited an elongated cell length and had multiple septa, suggesting that both MtrA and MtrB regulate cell division of Mab. Subsequently, an ethidium bromide accumulation assay disclosed that the absence of either mtrA or mtrB or both significantly increased cell envelope permeability. In summary, this study suggests that mtrA and mtrB play an important role in the intrinsic resistance and virulence of Mab by affecting cell division and altering cell permeability. Consequently, MtrA and MtrB represent promising targets for the discovery of anti-Mab drugs. HIGHLIGHTS Knockout of mtrA, mtrB or mtrAB leads to increased sensitivity of M. abscessus in vitro and in vivo . The mtrA, mtrB or mtrAB knockout M. abscessus strains exhibit highly reduced virulence. MtrA and MtrB are potential targets for anti- M. abscessus drug discovery. Knockout of mtrA, mtrB or mtrAB results in defective cell division in M. abscessus .

Abstract Drug-resistant tuberculosis (DR-TB) results from infection by Mycobacterium tuberculosis strains resistant to at least rifampin or isoniazid. To improve the treatment outcome in DR-TB, therapeutic vaccines are considered an ideal choice as they can enhance pathogen clearance and minimize disease sequelae. To date, there is no therapeutic vaccine reported to be effective when combined with a chemotherapy regimen against DR-TB. The only available TB vaccine, the M. bovis BCG (BCG) is susceptible to several anti-TB drugs hence not a perfect option for therapeutic vaccination. Herein, we developed a recombinant BCG (RdrBCG) overexpressing Ag85B and Rv2628 with resistance to selected anti-TB drugs. When administered three times adjunct to a second-line anti-TB regimen in a classical murine model of DR-TB, the RdrBCG lowered lung M. tuberculosis colony-forming units by 1 log 10 . Furthermore, vaccination with the RdrBCG adjunct to TB chemotherapy minimized lung tissue pathology in mice. Most importantly, the RdrBCG maintained the exogenously inserted genes and showed almost the same virulence as its parent BCG Tice strain in severe combined immune-deficient mice. All these suggested that the RdrBCG was stable, safe and effective. Hence, the “recombinant” plus “drug-resistant” BCG strategy could be a useful concept for developing therapeutic vaccines against DR-TB.