Abstract The broad research use of organoids from high-grade serous ovarian carcinoma (HGSC) has been hampered by low culture success rates and limited availability of fresh tumor material. Here we describe a method for generation and long-term expansion of HGSC organoids with efficacy markedly improved over previous reports (55% vs. 23-38%). We established organoids from cryopreserved material, demonstrating the feasibility of using viably biobanked tissue for HGSC organoid derivation. Genomic, histologic and single-cell transcriptomic analyses revealed that organoids recapitulated genetic and phenotypic features of original tumors. Organoid drug responses correlated with clinical treatment outcomes, although in culture conditions-dependent manner and only in organoids maintained in human plasma-like medium (HPLM). Organoids from consenting patients are available to the research community through a public biobank and organoid genomic data explorable through an interactive online tool. Taken together, this resource facilitates the application of HGSC organoids in basic and translational ovarian cancer research.

ABSTRACT Ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) is typically diagnosed at an advanced stage, with multiple genetically heterogeneous clones existing in the tumors long before therapeutic intervention. Herein we characterized HGSC evolutionary states using whole-genome sequencing data from 214 samples of 55 HGSC patients in the prospective, longitudinal, multiregion DECIDER study. Comparison of the tissues revealed that site-of-origin samples have 70% more unique clones than the metastatic tumors or ascites. By integrating clonal composition and topology of HGSC tumors we discovered three evolutionary states that represent a continuum from genomically highly variable to stable tumors with significant association to treatment response. The states and their evolutionary trajectories were characterized by unique, targetable pathways, which were validated with RNA-seq data. Our study reveals that genomic heterogeneity is unaffected by the current standard-of-care and pinpoints effective treatment targets for each group. All genomics data are available via an interactive visualization platform for rapid exploration.

To uncover the intricate, chemotherapy-induced spatiotemporal remodeling of the tumor microenvironment, we conducted integrative spatial and molecular characterization of 97 high-grade serous ovarian cancer (HGSC) samples collected before and after chemotherapy. Using single-cell and spatial analyses, we identify increasingly versatile immune cell states, which form spatiotemporally dynamic microcommunities at the tumor-stroma interface. We demonstrate that chemotherapy triggers spatial redistribution and exhaustion of CD8+ T cells due to prolonged antigen presentation by macrophages, both within interconnected myeloid networks termed "Myelonets" and at the tumor stroma interface. Single-cell and spatial transcriptomics identifies prominent TIGIT-NECTIN2 ligand-receptor interactions induced by chemotherapy. Using a functional patient-derived immuno-oncology platform, we show that CD8+T-cell activity can be boosted by combining immune checkpoint blockade with chemotherapy. Our discovery of chemotherapy-induced myeloid-driven spatial T-cell exhaustion paves the way for novel immunotherapeutic strategies to unleash CD8+ T-cell-mediated anti-tumor immunity in HGSC.

ABSTRACT Homologous recombination DNA-repair deficiency (HRD) is a common driver of genomic instability and confers a therapeutic vulnerability in cancer. The accurate detection of somatic allelic imbalances (AIs) has been limited by methods focused on BRCA1/2 mutations and using mixtures of cancer types. Using pan-cancer data, we revealed distinct patterns of AIs in high-grade serous ovarian cancer (HGSC). We used machine learning and statistics to generate improved criteria to identify HRD in HGSC (ovaHRDscar). ovaHRDscar significantly predicted clinical outcomes in three independent patient cohorts with higher precision than previous methods. Characterization of 98 spatiotemporally distinct metastatic samples revealed low intra-patient variation and indicated the primary tumor as the preferred site for clinical sampling in HGSC. Further, our approach improved the prediction of clinical outcomes in triple-negative breast cancer (tnbcHRDscar), validated in two independent patient cohorts. In conclusion, our tumor-specific, systematic approach has the potential to improve patient selection for HR-targeted therapies.

Ovarian tissue cryopreservation has been successfully applied worldwide for fertility preservation. Correctly selecting the ovarian tissue with high follicle loading for freezing and reimplantation increases the likelihood of restoring ovarian function, but it is a challenging process. In this work, we explore the use of three-dimensional spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to identify different follicular stages, especially primary follicles, compare the identifications with H&E images, and measure the size and age-related follicular density distribution differences in mice ovaries. We use the thickness of the layers of granulosa cells to differentiate primordial and primary follicles from secondary follicles. The measured dimensions and age-related follicular distribution agree well with histological images and physiological aging. Finally, we apply attenuation coefficient map analyses to significantly improve the image contrast and the contrast-to-noise ratio (p < 0.001), facilitating follicle identification and quantification. We conclude that SD-OCT is a promising method to noninvasively evaluate ovarian follicles.

Abstract Hypoxia is a common feature of many solid tumors due to aberrant proliferation and angiogenesis and has been associated with tumor progression and metastasis. Most of the well-known hypoxia effects are mediated through hypoxia-inducible factors (HIFs), but the long-lasting effect of hypoxia beyond the immediate HIF regulation remains less understood. Here we show that hypoxia exerts a prolonged effect to promote metastasis. Using breast cancer patient-derived circulating tumor cell (CTC) lines and common breast cancer cell lines, we found that hypoxia downregulates tumor intrinsic type I interferon (IFN) signaling and its downstream antigen presentation (AP) machinery in luminal breast cancer cells, via both HIF-dependent and HIF-independent mechanisms. Hypoxia induced IFN/AP suppression can last longer than the hypoxic exposure, presenting a “hypoxic memory” phenotype. Hypoxic memory of IFN/AP downregulation is established by specific hypoxic priming, and cells with hypoxic memory have an enhanced ability for tumorigenesis and metastasis. The histone deacetylase inhibitor (HDACi) Entinostat can erase the hypoxic memory and improve the immune clearance of tumor cells when combined with checkpoint immunotherapies in a syngeneic breast cancer mouse model. These results point to a novel mechanism for hypoxia facilitated tumor progression, through a long-lasting memory that provides advantages for CTCs during the metastatic cascade. Significance: We revealed a novel hypoxic memory of prolonged suppression of tumor intrinsic type I IFN and AP signals that promote tumorigenesis and metastasis, suggesting novel mechanistic understanding of the immune evasive properties of CTCs.

Abstract L1 retrotransposons are the only protein-coding active transposable elements in the human genome. Although silenced during normal conditions, they are highly expressed in human epithelial cancers including high-grade serous ovarian cancer (HGSC), where they transcribe to form L1 mRNA and subsequently integrate into the genome by a process called retrotransposition. Despite of high L1 protein expression in the earliest phases of HGSC, these tumors do not accrue many somatic L1 insertions. To understand this unexplained disconnect, we monitored the transcription and retrotransposition activity of two frequently expressed retrotransposition-competent (RC)-L1 (RC-L1) in 64 clinical tumor specimens from 34 HGSC patients and found that despite the presence of RC-L1 mRNA, a third of samples did not acquire somatic L1 insertions. In addition to high inter-patient variability in retrotransposition frequency, there was remarkable intra-patient heterogeneity in L1 insertion patterns between tumor sites, indicating that L1 retrotransposition is highly dynamic in vivo . Comparison of genomic and transcriptomic features of L1-null tumors with L1-high tumors (those with ≥5 somatic L1 insertions) showed that retrotransposition was favored by increased rate of cell proliferation.