Abstract Deconvolution methods infer levels of immune and stromal infiltration from bulk expression of tumor samples. These methods allow projection of characteristics of the tumor microenvironment, known to affect patient outcome and therapeutic response, onto the millions of bulk transcriptional profiles in public databases, many focused on uniquely valuable and clinically-annotated cohorts. Despite the wide development of such methods, a standardized dataset with ground truth to evaluate their performance has been lacking. We generated and sequenced in vitro and in silico admixtures of tumor, immune, and stromal cells and used them as ground truth in a community-wide DREAM Challenge that provided an objective, unbiased assessment of six widely-used published deconvolution methods and of 22 new analytical approaches developed by international teams. Our results demonstrate that existing methods predict many cell types well, while team-contributed methods highlight the potential to resolve functional states of T cells that were either not covered by published reference signatures or estimated poorly by some published methods. Our assessment and the open-source implementations of top-performing methods will allow researchers to apply the deconvolution approach most appropriate to querying their cell type of interest. Further, our publicly-available admixed and purified expression profiles will be a valuable resource to those developing deconvolution methods, including in non-malignant settings involving immune cells.

Abstract Recent studies have emphasized the importance of single-cell spatial biology, yet available assays for spatial transcriptomics have limited gene recovery or low spatial resolution. Here we introduce CytoSPACE, a method for aligning single-cell and spatial transcriptomes via convex linear optimization. Across diverse platforms and tissue types, we show that CytoSPACE outperforms previous methods with respect to noise-tolerance, accuracy, and efficiency, enabling improved analysis of spatial transcriptomics data at single-cell resolution.

In the skin, tissue injury results in fibrosis in the form of scars composed of dense extracellular matrix deposited by fibroblasts. The therapeutic goal of regenerative wound healing has remained elusive in part because principles of fibroblast programming and adaptive response to injury remain incompletely understood. Here, we present a multimodal -omics platform for the comprehensive study of cell populations in complex tissue, which has allowed us to characterize the cells involved in wound healing across both time and space. We employ a stented wound model that recapitulates human tissue repair kinetics and multiple Rainbow transgenic lines to precisely track fibroblast fate during the physiologic response to injury. Through integrated analysis of single cell chromatin landscapes and gene expression states, coupled with spatial transcriptomic profiling, we are able to impute fibroblast epigenomes with temporospatial resolution. This has allowed us to define the mechanisms controlling cell fate during migration, proliferation, and differentiation following tissue injury and thereby reexamine the canonical phases of wound healing. These findings have broad implications for the study of tissue repair in complex organ systems.

Abstract Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) has transformed our understanding of cell fate in developmental systems. However, identifying the molecular hallmarks of potency – the capacity of a cell to differentiate into other cell types – has remained challenging. Here, we introduce CytoTRACE 2, an interpretable deep learning framework for characterizing potency and differentiation states on an absolute scale from scRNA-seq data. Across 31 human and mouse scRNA-seq datasets encompassing 28 tissue types, CytoTRACE 2 outperformed existing methods for recovering experimentally determined potency levels and differentiation states covering the entire range of cellular ontogeny. Moreover, it reconstructed the temporal hierarchy of mouse embryogenesis across 62 timepoints; identified pan-tissue expression programs that discriminate major potency levels; and facilitated discovery of cellular phenotypes in cancer linked to survival and immunotherapy resistance. Our results illuminate a fundamental feature of cell biology and provide a broadly applicable platform for delineating single-cell differentiation landscapes in health and disease.

SUMMARY Metastasis is responsible for the majority of breast cancer-related deaths, however identifying the cellular determinants of metastasis has remained challenging. Here, we identified a minority population of immature THY1 + / VEGFA + tumor epithelial cells in human breast tumor biopsies that display angiogenic features and are marked by the expression of the oncogene, LMO2 . Higher abundance of LMO2 + basal cells correlated with tumor endothelial content and predicted poor distant recurrence-free survival in patients. Using MMTV-PyMT/Lmo2 CreERT2 mice, we demonstrated that Lmo2 lineage- traced cells have a higher propensity to metastasize. LMO2 knockdown in human breast tumors reduced lung metastasis by impairing intravasation, leading to a reduced frequency of circulating tumor cells. Mechanistically, we find that LMO2 binds to STAT3 and is required for STAT3 activation by TNFα and IL6. Collectively, our study identifies a population of metastasis-initiating cells with angiogenic features and establishes the LMO2-STAT3 signaling axis as a therapeutic target in breast cancer metastasis. One sentence summary LMO2 modulates STAT3 signaling in breast cancer metastasis.

ABSTRACT Acral melanoma, the most common melanoma subtype among non-Caucasian individuals, is associated with poor prognosis. However, its key molecular drivers remain obscure. Here, we performed integrative genomic and clinical profiling of acral melanomas from a cohort of 104 patients treated in North America or China. We found that recurrent, late-arising amplifications of cytoband chr22q11.21 are a leading determinant of inferior survival, strongly associated with metastasis, and linked to downregulation of immunomodulatory genes associated with response to immune checkpoint blockade. Unexpectedly, LZTR1 – a known tumor suppressor in other cancers – is a key candidate oncogene in this cytoband. Silencing of LZTR1 in melanoma cell lines caused apoptotic cell death independent of major hotspot mutations or melanoma subtypes. Conversely, overexpression of LZTR1 in normal human melanocytes initiated processes associated with metastasis, including anchorage-independent growth, formation of spheroids, and increased levels of MAPK and SRC activities. Our results provide new insights into the etiology of acral melanoma and implicate LZTR1 as a key tumor promoter and therapeutic target.

Hematopoiesis is an essential process that evolved in multicellular animals. At the heart of this process are hematopoietic stem cells (HSCs), which are multipotent, self-renewing and generate the entire repertoire of blood and immune cells throughout life. Here we studied the hematopoietic system of Botryllus schlosseri, a colonial tunicate that has vasculature, circulating blood cells, and interesting characteristics of stem cell biology and immunity. Self-recognition between genetically compatible B. schlosseri colonies leads to the formation of natural parabionts with shared circulation, whereas incompatible colonies reject each other. Using flow-cytometry, whole-transcriptome sequencing of defined cell populations, and diverse functional assays, we identified HSCs, progenitors, immune-effector cells, the HSC niche, and demonstrated that self-recognition inhibits cytotoxic reaction. Our study implies that the HSC and myeloid lineages emerged in a common ancestor of tunicates and vertebrates and suggests that hematopoietic bone marrow and the B. schlosseri endostyle niche evolved from the same origin.

Triple-negative breast cancer (TNBC) is a poor prognosis disease with no clinically approved targeted therapies. Here, using in vitro and in vivo RNA interference (RNAi) screens in TNBC patient-derived xenografts (PDX), we identify cyclin dependent kinase 19 (CDK19) as a potential therapeutic target. Using in vitro and in vivo TNBC PDX models, we validated the inhibitory effect of CDK19 knockdown on tumor initiation, proliferation and metastases. Despite this, CDK19 knockdown did not affect the growth of non-transformed mammary epithelial cells. Using CD10 and EpCAM as novel tumor initiating cell (TIC) markers, we found the EpCAM(med/high)/(CD10-/low) TIC sub-population to be enriched in CDK19 and a putative cellular target of CDK19 inhibition. Comparative gene expression analysis of CDK19 and CDK8 knockdowns revealed that CDK19 regulates a number of cancer-relevant pathways, uniquely through its own action and others in common with CDK8. Furthermore, although it is known that CDK19 can act at enhancers, our CHIP-Seq studies showed that CDK19 can also epigenetically modulate specific H3K27Ac enhancer signals which correlate with gene expression changes. Finally, to assess the potential therapeutic utility of CDK19, we showed that both CDK19 knockdown and chemical inhibition of CDK19 kinase activity impaired the growth of pre-established PDX tumors in vivo. Current strategies inhibiting transcriptional co-factors and targeting TICs have been limited by toxicity to normal cells. Because of CDK19s limited tissue distribution and the viability of CDK19 knockout mice, CDK19 represents a promising therapeutic target for TNBC.

Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) is a powerful approach for reconstructing cellular differentiation trajectories. However, inferring both the state and direction of differentiation without prior knowledge has remained challenging. Here we describe a simple yet robust determinant of developmental potential—the number of detectably expressed genes per cell—and leverage this measure of transcriptional diversity to develop a new framework for predicting ordered differentiation states from scRNA-seq data. When evaluated on ~150,000 single-cell transcriptomes spanning 53 lineages and five species, our approach, called CytoTRACE, outperformed previous methods and ~19,000 molecular signatures for resolving experimentally-confirmed developmental trajectories. In addition, it enabled unbiased identification of tissue-resident stem cells, including cells with long-term regenerative potential. When used to analyze human breast tumors, we discovered candidate genes associated with less-differentiated luminal progenitor cells and validated GULP1 as a novel gene involved in tumorigenesis. Our study establishes a key RNA-based correlate of developmental potential and provides a new platform for robust delineation of cellular hierarchies (https://cytotrace.stanford.edu).