Abstract The dynamic life histories of microeukaryotes present a challenge for determining their role in the nutrient cycles that support marine ecosystems. For instance, cellular differentiation is one life history strategy that enables a single celled microeukaryotic species to produce morphologically and physiologically distinct types of cells with different ecological functions. Here we report that cell differentiation in the marine choanoflagellate Salpingoeca rosetta endows one of its cell types with the ability to utilize insoluble ferric colloids for improved growth through the expression of a cytochrome b561 iron reductase ( cytb561a ). This gene is an ortholog of the mammalian duodenal cytochrome b561 ( DCYTB ) that reduces ferric cations prior to their uptake in gut epithelia and is part of an iron utilization toolkit that choanoflagellates and their closest living relatives, the animals, inherited from a last common eukaryotic ancestor. In a database of oceanic metagenomes, the abundance of cytb561a transcripts from choanoflagellates positively correlates with upwellings, which are a major source of ferric colloids in marine environments. As this predominant form of iron is largely inaccessible to cell-walled microbes, choanoflagellates and other phagotrophic eukaryotes may serve critical ecological roles by first acquiring ferric colloids through phagocytosis and then cycling this essential nutrient through iron utilization pathways. These findings provide insight into the ecological roles choanoflagellates perform and may inform reconstructions of early animal evolution where functionally distinct cell types became an integrated whole at the origin of animal multicellularity.

Abstract Animal kinases regulate cellular responses to environmental stimuli, including cell differentiation, migration, survival, and response to stress, but the ancestry of these functions is poorly understood. Choanoflagellates, the closest living relatives of animals, encode homologs of diverse animal kinases and have emerged as model organisms for reconstructing animal origins. However, efforts to study kinase signaling in choanoflagellates have been constrained by the limitations of currently available genetic tools. Here we demonstrate that small molecule approaches provide a complementary and scalable approach for studying kinase function in choanoflagellates. To study the physiological roles of choanoflagellate kinases, we established two high-throughput platforms to screen the model choanoflagellate Salpingoeca rosetta with a curated library of human kinase inhibitors. We identified 95 diverse kinase inhibitors that disrupt S. rosetta cell proliferation. By exploring structure-activity relationships of one inhibitor, sorafenib, we identified a p38 kinase as a regulator of heat and oxidative stress in S. rosetta . This finding indicates a conserved p38 function between choanoflagellates, animals, and fungi. Moreover, this study demonstrates that existing kinase inhibitors can serve as powerful tools to examine the ancestral roles of kinases that regulate modern animal development.

Abstract Little is known about the origins of the transcriptional modules that coordinate cell-type specific functions in animals. The controlled expression of one cellular feature – the cilium – was likely critical during early animal evolution. Two key transcription factors, RFX and FoxJ1, coordinate ciliogenesis in animals but are absent from the genomes of most other ciliated eukaryotes, raising the question of how the transcriptional regulation of ciliogenesis has evolved. To reconstruct the evolution of the RFX/FoxJ1 transcriptional module and its role in the regulation of ciliogenesis, we investigated RFX and FoxJ1 function in one of the closest living relatives of animals, the choanoflagellate Salpingoeca rosetta . Targeted disruption of the S. rosetta RFX homolog cRFXa resulted in delayed cell proliferation and aberrant ciliogenesis, marked by the collapse and resorption of nascent cilia. Ciliogenesis genes and foxJ1 were significantly down-regulated in cRFXa mutants, consistent with a pre-animal ancestry for this transcriptional module. We also found that cRFXa protein preferentially binds to a sequence motif that is enriched in the promoters of S. rosetta ciliary genes and matches the sequence motif bound by animal RFX proteins. These findings suggest that RFX coordinated ciliogenesis before the divergence of animals and choanoflagellates, and that the deployment of this module may have provided a mechanism to differentiate ciliated and non-ciliated cell types in early animal evolution.

Multicellularity evolved multiple times independently during eukaryotic diversification. Two distinct mechanisms underpin multicellularity: clonal development (serial cell division of a single precursor cell) and aggregation (in which independent cells assemble into a multicellular entity). Clonal and aggregative development are traditionally considered to be mutually exclusive and to result from independent acquisitions of multicellularity. Here, we show that the choanoflagellate Choanoeca flexa, a close relative of animals that forms contractile monolayers of cells (or "sheet colonies"), develops by an unconventional intermediate mechanism that we name "clonal-aggregative multicellularity". We find that C. flexa sheets can form through purely clonal processes, purely aggregative processes, or a combination of both, depending on experimental conditions. To assess the ecological relevance of these findings, we characterize the natural context of multicellular development in the native environment of C. flexa on the island of Curaçao. We show that the C. flexa life cycle is environmentally regulated by extreme salinity fluctuations in splash pools undergoing cycles of evaporation and refilling. Upon desiccation, C. flexa colonies dissociate into drought-resistant quiescent cells, which resume activity and reform multicellular sheets after rehydration. We hypothesize that clonal-aggregative development reflects selection for fast transitions into and out of multicellularity in the ephemeral context of coastal splash pools. Our findings underscore the potential of the exploration of biodiversity to reveal new fundamental biological phenomena and expand the known option space for both multicellular development and for the origin of animal multicellularity.

We discovered a virus infecting Entomophthora muscae, a behavior-manipulating fungal pathogen of dipterans. The virus, which we name Entomophthovirus, is a capsid-forming, positive-strand RNA virus in the viral family iflaviridae, whose known members almost exclusively infect insects. We show that the virus RNA is expressed at high levels in fungal cells in vitro and during in vivo infections of Drosophila melanogaster, and that virus particles are present in E. muscae. Two close relatives of the virus had been previously described as insect viruses based on the presence of viral genomes in transcriptomes assembled from RNA extracted from wild dipterans. By analyzing sequencing data from these earlier reports, we show that both dipteran samples were co-infected with E. muscae. We also find the virus in RNA sequencing data from samples of two other species of dipterans, Musca domestica and Delia radicum, known to be infected with E. muscae. These data establish that Entomophthovirus is widely, and seemingly obligately, associated with E. muscae. As other members of the iflaviridae cause behavioral changes in insects, we speculate on the possibility that Entomophthovirus plays a role in E. muscae involved host manipulation.

Many tissues fold during development into complex shapes. Engineering this process in vitro would represent an important advance for tissue engineering. We use embryonic tissue explants, finite element modeling, and 3D cell patterning techniques to show that a mechanical compaction of the ECM during mesenchymal condensation can drive tissue folding along programmed trajectories. The process requires cell contractility, generates strains at nearby tissue interfaces, and causes specific patterns of collagen alignment around and between condensates. Aligned collagen fibers support elevated tensions that promote the folding of interfaces along paths that can be predicted by finite element modeling. We demonstrate the robustness and versatility of this strategy for sculpting tissue interfaces by directing the morphogenesis of a variety of folded tissue forms from engineered patterns of mesenchymal condensates. These studies provide insight into the active mechanical properties of the embryonic mesenchyme and establish entirely new strategies for more robustly directing tissue morphogenesis ex vivo, without genetic engineering.

The construction of three-dimensional (3D) microvascular networks with defined structures remains challenging. Emerging bioprinting strategies provide a means of patterning endothelial cells (ECs) into the geometry of 3D microvascular networks, but the microenvironmental cues necessary to promote their self-organization into cohesive and perfusable microvessels are unknown. To this end, we reconstituted microvessel formation in vitro by patterning thin lines of closely packed ECs fully embedded within a 3D extracellular matrix (ECM) and observed how different microenvironmental parameters influenced EC behaviors and their self-organization into microvessels. We found that the inclusion of fibrillar matrices, such as collagen I, into the ECM positively influenced cell condensation into extended geometries such as cords. We also identified the presence of a high molecular weight protein(s) in fetal bovine serum (FBS) that negatively influenced EC condensation. This component destabilized cord structure by promoting cell protrusions and destabilizing cell-cell adhesions. Endothelial cords cultured in the presence of fibrillar collagen and the absence of this protein activity were able to polarize, lumenize, incorporate mural cells, and support fluid flow. These optimized conditions allowed for the construction of branched and perfusable microvascular networks directly from patterned cells in as little as three days. These findings reveal important design principles for future microvascular engineering efforts based on bioprinting techniques.