Abstract Using a high-throughput mitochondrial phenotyping platform to quantify multiple mitochondrial features among molecularly-defined immune cell subtypes, we quantify the natural variation in citrate synthase, mitochondrial DNA copy number (mtDNAcn), and respiratory chain enzymatic activities in human neutrophils, monocytes, B cells, and naïve and memory T lymphocyte subtypes. In mixed peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from the same individuals, we show to what extent mitochondrial measures are confounded by both cell type distributions and contaminating platelets. Cell subtype-specific measures among women and men spanning 4 decades of life indicate potential age- and sex-related differences, including an age-related elevation in mtDNAcn, which are masked or blunted in mixed PBMCs. Finally, a proof-of-concept, repeated-measures study in a single individual validates cell type differences and also reveals week-to-week changes in mitochondrial activities. Larger studies are required to validate and mechanistically extend these findings. These mitochondrial phenotyping data build upon established immunometabolic differences among leukocyte sub-populations, and provide foundational quantitative knowledge to develop interpretable blood-based assays of mitochondrial health.

Abstract Circulating cell-free mitochondrial DNA (cf-mtDNA) is an emerging biomarker of psychobiological stress and disease which predicts mortality and is associated with various disease states. To evaluate the contribution of cf-mtDNA to health and disease states, standardized high-throughput procedures are needed to quantify cf-mtDNA in relevant biofluids. Here, we describe MitoQuicLy: Mito chondrial DNA Qu antification in c ell-free samples by Ly sis. We demonstrate high agreement between MitoQuicLy and the commonly used column-based method, although MitoQuicLy is faster, cheaper, and requires a smaller input sample volume. Using 10 µL of input volume with MitoQuicLy, we quantify cf-mtDNA levels from three commonly used plasma tube types, two serum tube types, and saliva. We detect, as expected, significant inter-individual differences in cf-mtDNA across different biofluids. However, cf-mtDNA levels between concurrently collected plasma, serum, and saliva from the same individual differ on average by up to two orders of magnitude and are poorly correlated with one another, pointing to different cf-mtDNA biology or regulation between commonly used biofluids in clinical and research settings. Moreover, in a small sample of healthy women and men (n=34), we show that blood and saliva cf-mtDNAs correlate with clinical biomarkers differently depending on the sample used. The biological divergences revealed between biofluids, together with the lysis-based, cost-effective, and scalable MitoQuicLy protocol for biofluid cf-mtDNA quantification, provide a foundation to examine the biological origin and significance of cf-mtDNA to human health.

Abstract Mitochondria contain their own genome that can be released in multiple biofluids such as blood and cerebrospinal fluid, as cell-free mitochondrial DNA (cf-mtDNA). In clinical studies, single measures of blood cf-mtDNA predict mortality, and higher cf-mtDNA levels are associated with mental and physical stress. However, the dynamics of cf-mtDNA has not been defined, and whether it can be measured non-invasively like other neuroendocrine markers in saliva has not been examined. Here we report cf-mtDNA in human saliva and establish its natural within-person dynamic behavior across multiple weeks. In a small proof-of-principle cohort of healthy adults, we first develop an approach to rapidly quantify salivary cf-mtDNA without DNA extraction, and demonstrate the existence of saliva cf-mtDNA. We then deploy this approach to perform an intensive repeated-measures analysis of two healthy men studied at 4 daily timepoints over 53-60 consecutive days (n=212-220 observations each) with parallel measures of steroid hormones, self-reported daily mood, and health-related behaviors. Salivary cf-mtDNA exhibited a robust awakening response reaching up to two orders of magnitude 30-45 minutes after awakening, varied from day-to-day, and moderately correlated with the cortisol awakening response. No consistent association with self-reported daily mood/health-related behaviors were found, although this requires further examination in more extensive studies. Dynamic variation in cf-mtDNA was inversely related with salivary interleukin 6 (IL6), inconsistent with a pro-inflammatory effect of salivary cf-mtDNA. The highly dynamic behavior of salivary cf-mtDNA opens the door to non-invasive studies examining the relevance of mtDNA signaling in relation to human health.

Abstract Objective Psychosocial stress is transduced into disease risk through energy-dependent release of hormones that affect target organs, tissues, and cells. The magnitude of the physiological stress responses reflects both systemic levels of these hormones and the sensitivity of target tissues to their effects. Thus, differential expression of receptors across organs likely contributes to stress transduction. Here we provide a quantitative whole-body map of glucocorticoid and adrenergic receptor expression. Methods We systematically examined gene expression levels for the glucocorticoid receptor (GR), α- and β-adrenergic receptors (AR-α1B, AR-α2B AR-β2, and AR-β3), across 55 different organs using the Human Protein Atlas dataset. We also leveraged the Human Proteome Map and MitoCarta3.0 data to examine receptor protein levels and, given the energy-dependence of the stress response, the link between stress hormone receptor density and mitochondrial pathways. Finally, we tested the functional interplay between GR activation and AR expression in living human cells. Results The GR was expressed ubiquitously across all investigated organ systems. Immune tissues and cells expressed the highest GR RNA and protein levels. In contrast, AR subtypes showed lower and more localized expression patterns. Co-regulation was found between GR and AR-α1B, as well as between AR-α1B and AR-α2B. In human fibroblasts, activating the GR selectively increased AR-β2 (3.6-fold) and AR-α1B (2.2-fold) expression, confirming their interaction. Consistent with the energetic cost of stress responses, GR and AR expression were positively associated with the expression of key mitochondrial pathways. Conclusion Our results provide a cartography of GR and AR expression across the human body. Tissue-specific stress hormone receptor expression patterns could make specific organ systems more responsive to the sustained, energetically expensive, neuroendocrine signaling pathways triggered by chronic psychosocial stress.

GDF15 (growth differentiation factor 15) is a marker of cellular energetic stress linked to physical-mental illness, aging, and mortality. However, questions remain about its dynamic properties and measurability in human biofluids other than blood. Here, we examine the natural dynamics and psychobiological regulation of plasma and saliva GDF15 in four human studies representing 4,749 samples from 188 individuals. We show that GDF15 protein is detectable in saliva (8% of plasma concentration), likely produced by salivary glands secretory duct cells. Using a brief laboratory socio-evaluative stressor paradigm, we find that psychosocial stress increases plasma (+3.5-5.9%) and saliva GDF15 (+43%) with distinct kinetics, within minutes. Moreover, saliva GDF15 exhibits a robust awakening response, declining by ~40-89% within 30-45 minutes from its peak level at the time of waking up. Clinically, individuals with genetic mitochondrial OxPhos diseases show elevated baseline plasma and saliva GDF15, and post-stress GDF15 levels in both biofluids correlate with multi-system disease severity, exercise intolerance, and the subjective experience of fatigue. Taken together, our data establish that saliva GDF15 is dynamic, sensitive to psychological states, a clinically relevant endocrine marker of mitochondrial diseases. These findings also point to a shared psychobiological pathway integrating metabolic and mental stress.

Intrinsic biological mechanisms transduce psychological stress into physiological adaptation, but the role of mitochondria and mitochondrial DNA (mtDNA) in this process has not been defined in humans. Here, we show that similar to physical injury, psychological stress triggers elevation in circulating cell-free mtDNA (ccf-mtDNA). Healthy midlife adults exposed on two separate occasions to a brief psychological challenge exhibit a 2-3-fold increase in ccf-mtDNA, with no change in nuclear DNA levels, establishing the magnitude and specificity to ccf-mtDNA. In cell-based studies, we show that glucocorticoid signaling - a consequence of psychological stress in humans - is sufficient to induce mtDNA extrusion in a time frame consistent with human psychophysiology. Collectively, these findings provide the first evidence that psychological stress induces ccf-mtDNA and implicate glucocorticoid signaling as a trigger for ccf-mtDNA release. Further work is needed to examine the functional significance of psychological stress-induced ccf-mtDNA as a mitokine in humans.

Background: Pregnancy outcomes are influenced by maternal distress but the pathways underlying these effects are still unknown. Mitochondria, crucial for stress adaptation and energy production, may link psychosocial stress to its biological effects, especially during pregnancy when energy demands significantly increase. This study explores two mitochondrial markers-circulating cell-free mitochondrial DNA (cf-mtDNA) and Growth Differentiation Factor-15 (GDF15)-as potential mitochondrial health indicators linking maternal distress to pregnancy outcomes in two longitudinal studies from the USA and Turkey. Methods: We analyzed biological, demographic, and psychological data from women in two pregnancy studies: EPI (N=187, USA, Mean age=29.6(SD=6.2) and BABIP (N=198, Turkey, Mean age=32.4(SD=4.0)). Data were collected at multiple time points during the perinatal period, including late 2nd and 3rd trimester, with EPI also including additional data at early 2nd trimester and 4-14 months postpartum. Prenatal maternal psychological distress was measured as perceived stress, anxiety, and depressive symptoms. Plasma cf-mtDNA and GDF15 levels were assessed using qPCR and ELISA, respectively. Statistical analyses included Wilcoxon signed-rank tests, Spearman correlations, and Mann-Whitney tests. Results: Plasma cf-mtDNA levels did not change significantly during pregnancy in either study. Plasma GDF15 levels increased from early to late pregnancy in both studies and significantly decreased postpartum in EPI. Perinatal maternal distress in the late 2nd and 3rd trimesters was not associated with cf-mtDNA or GDF15 in either study. Metabolic distress, measured as higher pre-pregnancy BMI, was negatively correlated with GDF15 in the late 2nd trimester in EPI and showed a similar trend in BABIP. Similarly, higher maternal psychological distress in the early 2nd trimester were associated with lower cf-mtDNA and a trend for lower GDF15 in EPI. Finally, higher pre-pregnancy BMI and maternal distress in late pregnancy were linked to a smaller decline in GDF15 from late pregnancy to postpartum in EPI, suggesting an interaction between metabolic stress, prenatal distress and post-pregnancy physiological recovery. Conclusions: This study identified distinct patterns of plasma cf-mtDNA and GDF15 levels during the perinatal period across studies from two countries, revealing unique associations between maternal characteristics, prenatal distress, and pregnancy outcomes, suggesting that maternal distress can interact with energy mobilization during pregnancy.

Psychosocial experiences affect brain health and aging trajectories, but the molecular pathways underlying these associations remain unclear. Normal brain function relies heavily on energy transformation by mitochondria oxidative phosphorylation (OxPhos), and two main lines of evidence bi-directionally link mitochondria as both targets and drivers of psychosocial experiences. On the one hand, chronic stress exposure and possibly mood states alter multiple aspects of mitochondrial biology; and on the other hand, functional variations in mitochondrial OxPhos capacity alter social behavior, stress reactivity, and mood. However, knowledge on whether positive or negative psychosocial exposures and experiences are linked to mitochondrial biology in the human brain is currently unknown. By combining longitudinal antemortem assessments of psychosocial factors with postmortem brain (dorsolateral prefrontal cortex) proteomics in older adults, we found that positive experiences (e.g. higher well-being) are linked to greater abundance of the mitochondrial OxPhos machinery, whereas negative experiences (e.g. higher negative mood) are linked to lower OxPhos protein content. Combined, psychosocial factors explained 18% of the variance in the abundance of OxPhos complex I, the primary biochemical entry point that energizes brain mitochondria. To increase the sensitivity of our approach, we next interrogated mitochondrial psychobiological associations in specific neuronal and non-neuronal brain cells with single-nucleus RNA sequencing. These results revealed strong cell type specific associations, particularly between positive psychosocial experiences and molecular mitochondrial phenotypes in glial cells, whereas neurons tended to show opposite associations. Accordingly, in bulk transcriptomic analyses where all cells are pooled, these RNA-based associations were masked. Thus, our results highlight the likely underestimation of effect sizes in bulk brain tissues, and document novel cell type specific mitochondrial psychobiological associations in the human brain. Cell type specific mitochondrial recalibrations represent a potential psychobiological pathway linking positive and negative psychosocial experiences to human brain biology.

Summary Mitochondrial respiratory chain (RC) function requires the stoichiometric interaction among dozens of proteins but their co-regulation has not been defined in the human brain. Here, using quantitative proteomics across three independent cohorts we systematically characterized the co-regulation patterns of mitochondrial RC proteins in the human dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). Whereas the abundance of RC protein subunits that physically assemble into stable complexes were correlated, indicating their co-regulation, RC assembly factors exhibited modest co-regulation. Within complex I, nuclear DNA-encoded subunits exhibited >2.5-times higher co-regulation than mitochondrial (mt)DNA-encoded subunits. Moreover, mtDNA copy number was unrelated to mtDNA-encoded subunits abundance, suggesting that mtDNA content is not limiting. Alzheimer’s disease (AD) brains exhibited reduced abundance of complex I RC subunits, an effect largely driven by a 2-4% overall lower mitochondrial protein content. These findings provide foundational knowledge to identify molecular mechanisms contributing to age- and disease-related erosion of mitochondrial function in the human brain.

Abstract Aging-related muscle atrophy and weakness contribute to loss of mobility, falls and disability. Mitochondrial dysfunction is widely considered a key contributing mechanism to muscle aging. However, mounting evidence position physical activity as a confounding factor, making unclear whether muscle mitochondria accumulate bona fide defects with aging. To disentangle aging from physical activity-related mitochondrial adaptations, we functionally profiled skeletal muscle mitochondria in 51 inactive and 88 active men aged 20-93. Physical activity status conferred partial protection against age-related decline in physical performance. A trend for reduced muscle mitochondrial respiration with aging was observed in inactive but not in active participants, indicating that aging per se does not alter mitochondrial respiratory capacity. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production was unaffected by aging and active participants displayed higher ROS production. In contrast, mitochondrial calcium retention capacity decreased with aging regardless of physical activity status and correlated with muscle mass, performance and the stress-responsive metabokine GDF15. Targeting mitochondrial calcium handling may hold promise for treating aging-related muscle impairments.