Abstract Background The use of rumen microbial community (RMC) profiles to predict methane emissions has driven interest in ruminal DNA preservation and extraction protocols that can be processed cheaply while also maintaining or improving DNA quality for RMC profiling. Our standard approach for preserving rumen samples, as defined in the Global Rumen Census (GRC), requires time-consuming pre-processing steps of freeze drying and grinding prior to international transportation and DNA extraction. This impedes researchers unable to access sufficient funding or infrastructure. To circumvent these pre-processing steps, we investigated three methods of preserving rumen samples for subsequent DNA extraction, based on existing lysis buffers Tris-NaCl-EDTA-SDS (TNx2) and guanidine hydrochloride (GHx2), or 100% ethanol. Results Rumen samples were collected via stomach intubation from 151 sheep at two time-points two weeks apart. Each sample was separated into four subsamples and preserved using the three preservation methods and the GRC method (n = 4×302). DNA was extracted and sequenced using Restriction Enzyme-Reduced Representation Sequencing to generate RMC profiles. Differences in DNA yield, quality and integrity, and sequencing metrics were observed across the methods (p < 0.0001). Ethanol exhibited poorer quality DNA (A260/A230 < 2) and more failed samples compared to the other methods. Samples preserved using the GRC method had smaller relative abundances in gram-negative genera Anaerovibrio, Bacteroides, Prevotella, Selenomonas , and Succiniclasticum , but larger relative abundances in the majority of 56 additional genera compared to TNx2 and GHx2. However, log 10 relative abundances across all genera and time-points for TNx2 and GHx2 were on average consistent (R 2 > 0.99) but slightly more variable compared to the GRC method. Relative abundances were moderately to highly correlated (0.68 ± 0.13) between methods for samples collected within a time-point, which was greater than the average correlation (0.17 ± 0.11) between time-points within a preservation method. Conclusions The two modified lysis buffers solutions (TNx2 and GHx2) proposed in this study were shown to be viable alternatives to the GRC method for RMC profiling in sheep. Use of these preservative solutions reduces cost and improves throughput associated with processing and sequencing ruminal samples. This development could significantly advance implementation of RMC profiles as a tool for breeding ruminant livestock.

High-throughput sequencing methods that multiplex a large number of individuals have provided a cost-effective approach for discovering genome-wide genetic variation in large populations. These sequencing methods are increasingly being utilized in population genetic studies across a diverse range of species. One side-effect of these methods, however, is that one or more alleles at a particular locus may not be sequenced, particularly when the sequencing depth is low, resulting in some heterozygous genotypes being called as homozygous. Under-called heterozygous genotypes have a profound effect on the estimation of linkage disequilibrium and, if not taken into account, leads to inaccurate estimates. We developed a new likelihood method, GUS-LD, to estimate pairwise linkage disequilibrium using low coverage sequencing data that accounts for under-called heterozygous genotypes. Our findings show that accurate estimates were obtained using GUS-LD on low coverage sequencing data, whereas underestimation of linkage disequilibrium results if no adjustment is made for under-called heterozygotes.

Microbial community profiles have been associated with a variety of traits, including methane emissions in livestock, however, these profiles can be difficult and expensive to obtain for thousands of samples. The objective of this work was to develop a low-cost, high-throughput approach to capture the diversity of the rumen microbiome. Restriction enzyme reduced representation sequencing (RE-RRS) using ApeKI or PstI, and two bioinformatic pipelines (reference-based and reference-free) were compared to 16S rRNA gene sequencing using repeated samples collected two weeks apart from 118 sheep that were phenotypically extreme (60 high and 58 low) for methane emitted per kg dry matter intake (n=236). DNA was extracted from freeze-dried rumen samples using a phenol chloroform and bead-beating protocol prior to sequencing. The resulting sequences were used to investigate the repeatability of the rumen microbial community profiles, the effect of host genetics, laboratory and analytical method, and the genetic and phenotypic correlations with methane production. The results suggested that the best method was PstI RE-RRS analyzed with the reference-free approach via a correspondence analysis, with estimates for repeatability of 0.62±0.06, heritability 0.31±0.29, and genetic and phenotypic correlation with methane emissions of 0.88±0.25 and 0.64±0.05 respectively for the first component of correspondence analysis. The reference-free approach assigned 62.0±5.7% of reads to common 65 bp tags, much higher than the reference-based approach of 6.8±1.8% of reads assigned. Sensitivity studies suggested approximately 2000 samples could be sequenced in a single lane on an Illumina HiSeq 2500, therefore the current work of 118 samples/lane and future proposed 384 samples/lane are well within that threshold. Our approach is now being used to investigate host factors affecting the rumen and its association with a variety of production and environmental traits. With minor adaptations, our approach could be used to obtain microbial profiles from other metagenomic samples.

Genotypes are often used to assign parentage in agricultural and ecological settings. Sequencing can be used to obtain genotypes but does not provide unambiguous genotype calls, especially when sequencing depth is low in order to reduce costs. In that case, standard parentage analysis methods no longer apply. A strategy for using low-depth sequencing data for parentage assignment is developed here. It entails the use of relatedness estimates along with a metric termed excess mismatch rate which, for parent-offspring pairs or trios, is the difference between the observed mismatch rate and the rate expected under a model of inheritance and allele reads without error. When more than one putative parent has similar statistics, bootstrapping can provide a measure of the relatedness similarity. Putative parent-offspring trios can be further checked for consistency by comparing the offspring's estimated inbreeding to half the parent relatedness. Suitable thresholds are required for each metric. These methods were applied to a deer breeding operation consisting of two herds of different breeds. Relatedness estimates were more in line with expectation when the herds were analysed separately than when combined, although this did not alter which parents were the best matches with each offspring. Parentage results were largely consistent with those based on a microsatellite parentage panel with three discordant parent assignments out of 1561. Two models are investigated to allow the parentage metrics to be calculated with non-random selection of alleles. The tools and strategies given here allow parentage to be assigned from low-depth sequencing data.

Deer farming is a significant international industry. For genetic improvement, using genomic tools, an ordered array of DNA variants and associated flanking sequence across the genome is required. This work reports a comparative assembly of the deer genome and subsequent DNA variant identification. Next generation sequencing combined with an existing bovine reference genome enabled the deer genome to be assembled sufficiently for large-scale SNP discovery. In total, 28 Gbp of sequence data were generated from seven Cervus elaphus (European red deer and Canadian elk) individuals. After aligning sequence to the bovine reference genome build UMD 3.0 and binning reads into one Mbp groups; reads were assembled and analyzed for SNPs. Greater than 99% of the non-repetitive fraction of the bovine genome was covered by deer chromosomal scaffolds. We identified 1.8 million SNPs meeting Illumina InfiniumII SNP chip technical threshold. Markers on the published Red x Pere David deer linkage map were aligned to both UMD3.0 and the new deer chromosomal scaffolds. This enabled deer linkage groups to be assigned to deer chromosomal scaffolds, although the mapping locations remain based on bovine order. Genotyping of 270 SNPs on a Sequenom MS system showed that 88% of SNPs identified could be amplified. Also, inheritance patterns showed no evidence of departure from Hardy-Weinberg equilibrium. A comparative assembly of the deer genome, alignment with existing deer genetic linkage groups and SNP discovery has been successfully completed and validated facilitating application of genomic technologies for subsequent deer genetic improvement.