Despite recent improvements in sequencing methods, there remains a need for assays that provide high sequencing depth and comprehensive variant detection. Current methods1–4 are limited by the loss of native modifications, short read length, high input requirements, low yield or long protocols. In the present study, we describe nanopore Cas9-targeted sequencing (nCATS), an enrichment strategy that uses targeted cleavage of chromosomal DNA with Cas9 to ligate adapters for nanopore sequencing. We show that nCATS can simultaneously assess haplotype-resolved single-nucleotide variants, structural variations and CpG methylation. We apply nCATS to four cell lines, to a cell-line-derived xenograft, and to normal and paired tumor/normal primary human breast tissue. Median sequencing coverage was 675× using a MinION flow cell and 34× using the smaller Flongle flow cell. The nCATS sequencing requires only ~3 μg of genomic DNA and can target a large number of loci in a single reaction. The method will facilitate the use of long-read sequencing in research and in the clinic. Point mutations, structural variants and DNA methylation at target loci are assessed by nanopore sequencing.

Nanopore sequencing technology can rapidly and directly interrogate native DNA molecules. Often we are interested only in interrogating specific areas at high depth, but conventional enrichment methods have thus far proved unsuitable for long reads[1][1]. Existing strategies are currently limited by high input DNA requirements, low yield, short (<5kb) reads, time-intensive protocols, and/or amplification or cloning (losing base modification information). In this paper, we describe a technique utilizing the ability of Cas9 to introduce cuts at specific locations and ligating nanopore sequencing adaptors directly to those sites, a method we term ‘nanopore Cas9 Targeted-Sequencing’ (nCATS).We have demonstrated this using an Oxford Nanopore MinION flow cell (Capacity >10Gb+) to generate a median 165X coverage at 10 genomic loci with a median length of 18kb, representing a several hundred-fold improvement over the 2-3X coverage achieved without enrichment. We performed a pilot run on the smaller Flongle flow cell (Capacity ~1Gb), generating a median coverage of 30X at 11 genomic loci with a median length of 18kb. Using panels of guide RNAs, we show that the high coverage data from this method enables us to (1) profile DNA methylation patterns at cancer driver genes, (2) detect structural variations at known hot spots, and (3) survey for the presence of single nucleotide mutations. Together, this provides a low-cost method that can be applied even in low resource settings to directly examine cellular DNA. This technique has extensive clinical applications for assessing medically relevant genes and has the versatility to be a rapid and comprehensive diagnostic tool. We demonstrate applications of this technique by examining the well-characterized GM12878 cell line as well as three breast cell lines (MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231) with varying tumorigenic potential as a model for cancer.Contributions TG and WT constructed the study. TG performed the experiments. TG, IL, and FS analyzed the data. TG, JG, ER, RB and AH and developed the method. TG and WT wrote the paper [1]: #ref-1

Abstract Polymorphism in the human leukocyte antigen class I (HLA-I) and class II (HLA-II) genes is strongly implicated in susceptibility to immune-mediated diseases. However, the molecular effects of HLA genetic variation, including and beyond antigen presentation, remain unclear. Here we examined the effect of HLA genetic variation on the expression of 2940 plasma proteins using imputed HLA variants in 45,330 Europeans in the UK Biobank. We detected 504 proteins (17.1% of all proteins tested) affected by HLA genetic variation (HLA-pQTL), including widespread trans regulation of protein expression by autoimmune disease risk alleles. HLA-pQTL were enriched in gene families related to antigen presentation (e.g. B2M), T cell fate (CD8A; CD4), chemokines (CCL19; CCL21), and NK and macrophage receptors (KIR; LILRA/B), suggesting that HLA polymorphism affects both adaptive and innate immunity. HLA-pQTL also affected expression of diverse proteins with unclear roles in the immune response (e.g. SFTPD, LRPAP1, ENPP6, NPTX1), as well as drug targets for immune-mediated diseases, suggesting complex regulatory roles of the HLA loci. Among trans HLA-pQTL, HLA variants explained 0.1-42.9% of the protein expression variance. Fine-mapping revealed that most HLA-pQTL implicated amino acid positions within the peptide binding groove, suggesting that trans regulation of plasma protein expression by the HLA loci is primarily a consequence of antigen presentation. We also show that HLA-I and II uniquely affect different proteins and biological mechanisms. Altogether, our data reveal the effects of HLA genetic variation on protein expression and aid the interpretation of associations between HLA alleles and immune-mediated diseases.

Improved identification of structural variants (SVs) in cancer can lead to more targeted and effective treatment options as well as advance our basic understanding of disease progression. We performed whole genome sequencing of the SKBR3 breast cancer cell-line and patient-derived tumor and normal organoids from two breast cancer patients using 10X/Illumina, PacBio, and Oxford Nanopore sequencing. We then inferred SVs and large-scale allele-specific copy number variants (CNVs) using an ensemble of methods. Our findings demonstrate that long-read sequencing allows for substantially more accurate and sensitive SV detection, with between 90% and 95% of variants supported by each long-read technology also supported by the other. We also report high accuracy for long-reads even at relatively low coverage (25x-30x). Furthermore, we inferred karyotypes from these data using our enhanced RCK algorithm to present a more accurate representation of the mutated cancer genomes, and find hundreds of variants affecting known cancer-related genes detectable only through long-read sequencing. These findings highlight the need for long-read sequencing of cancer genomes for the precise analysis of their genetic instability.

Characterization of DNA binding sites for specific proteins is of fundamental importance in molecular biology. It is commonly addressed experimentally by chromatin immunoprecipitation and sequencing (ChIP-seq) of bulk samples (103-107 cells). We have developed an alternative method that uses a Chromatin Antibody-mediated Methylating Protein (ChAMP) composed of a GpC methyltransferase fused to protein G. By tethering ChAMP to a primary antibody directed against the DNA-binding protein of interest, and selectively switching on its enzymatic activity in situ, we generated distinct and identifiable methylation patterns adjacent to the protein binding sites. This method is compatible with methods of single-cell methylation-detection and single molecule methylation identification. Indeed, as every binding event generates multiple nearby methylations, we were able to confidently detect protein binding in long single molecules.

Understanding how the genome and the epigenome work together to control gene transcription has applications in our understanding of diseases such as human cancer. In this study, we combine the ability of NOMe-seq to simultaneously evaluate CpG methylation and chromatin accessibility, with long-read nanopore sequencing technology, a method we call nanoNOMe. We generated >60Gb whole-genome nanopore sequencing data for each of four human cell lines (GM12878, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231) including repetitive regions inaccessible by short read sequencing. Using the long reads, we find that we can observe phased methylation and chromatin accessibility, large scale pattern changes, and genetic changes such as structural variations from a single assay.