Most deaths from cancer are explained by metastasis, and yet large-scale metastasis research has been impractical owing to the complexity of in vivo models. Here we introduce an in vivo barcoding strategy that is capable of determining the metastatic potential of human cancer cell lines in mouse xenografts at scale. We validated the robustness, scalability and reproducibility of the method and applied it to 500 cell lines1,2 spanning 21 types of solid tumour. We created a first-generation metastasis map (MetMap) that reveals organ-specific patterns of metastasis, enabling these patterns to be associated with clinical and genomic features. We demonstrate the utility of MetMap by investigating the molecular basis of breast cancers capable of metastasizing to the brain-a principal cause of death in patients with this type of cancer. Breast cancers capable of metastasizing to the brain showed evidence of altered lipid metabolism. Perturbation of lipid metabolism in these cells curbed brain metastasis development, suggesting a therapeutic strategy to combat the disease and demonstrating the utility of MetMap as a resource to support metastasis research.

Abstract To accelerate the translation of cancer nanomedicine, we hypothesize that integrated genomic screens will improve understanding of the cellular processes governing nanoparticle trafficking. We developed a massively parallel high-throughput screening method leveraging barcoded, pooled cancer cell lines annotated with multi-omic data to investigate cell association patterns across a nanoparticle library spanning a range of formulations with clinical potential. This approach identified both the materials properties and cell-intrinsic features mediating nanoparticle-cell association. Coupling the data with machine learning algorithms, we constructed genomic nanoparticle trafficking networks and identified nanoparticle-specific biomarkers, including gene expression of SLC46A3. We engineered cell lines to validate SLC46A3 as a biomarker whose expression inversely predicts liposomal nanoparticle uptake both in vitro and in vivo. We further demonstrated the predictive capabilities extend beyond liposomal nanoparticles, regulating both uptake and transfection efficacy of solid lipid nanoparticles. Our work establishes the power of massively parallel pooled cell screens for nanoparticle delivery and enables the identification and utilization of biomarkers to rationally design nanoformulations for specific patient populations.

SUMMARY Natural killer (NK) cells are emerging as a promising therapeutic option in cancer. To better understand how cancer cells evade NK cells, we studied interacting NK and blood cancer cells using single-cell and genome-scale functional genomics screens. At single-cell resolution, interaction of NK and cancer cells induced distinct activation states in both cell types depending on the cancer cell lineage and molecular phenotype, ranging from more sensitive myeloid to more resistant B-lymphoid cancers. CRISPR screens uncovered cancer cell-intrinsic genes driving sensitivity and resistance, including antigen presentation and death receptor signaling mediators, adhesion molecules, protein fucosylation genes, and transcriptional regulators. CRISPR screens with a single-cell transcriptomic readout revealed how these cancer cell genes influenced the gene expression landscape of both cell types, including regulation of activation states in both cancer and NK cells by IFNγ signaling. Our findings provide a resource for rational design of NK cell-based therapies in blood cancers. HIGHLIGHTS Transcriptomic states of interacting NK cells and cancer cells depend on cancer cell lineage Molecular correlates of increased sensitivity of myeloid compared to B-lymphoid cancers include activating receptor ligands NCR3LG1, PVR, and ULBP1 New regulators of NK cell resistance from 12 genome-scale CRISPR screens include blood cancer-specific regulators SELPLG, SPN, and MYB Single-cell transcriptomics CRISPR screens targeting 65 genome-wide screen hits identify MHC-I, IFNy, and NF-κB regulation as underlying mechanisms

A challenge for screening new candidate drugs to treat cancer is that efficacy in cell culture models is not always predictive of efficacy in patients. One limitation of standard cell culture is a reliance on non-physiological nutrient levels to propagate cells. Which nutrients are available can influence how cancer cells use metabolism to proliferate and impact sensitivity to some drugs, but a general assessment of how physiological nutrients affect cancer cell response to small molecule therapies is lacking. To enable screening of compounds to determine how the nutrient environment impacts drug efficacy, we developed a serum-derived culture medium that supports the proliferation of diverse cancer cell lines and is amenable to high-throughput screening. We used this system to screen several small molecule libraries and found that compounds targeting metabolic enzymes were enriched as having differential efficacy in standard compared to serum-derived medium. We exploited the differences in nutrient levels between each medium to understand why medium conditions affected the response of cells to some compounds, illustrating how this approach can be used to screen potential therapeutics and understand how their efficacy is modified by available nutrients.

Summary Cyclin-dependent kinase 9 (CDK9) coordinates signaling events that regulate RNA polymerase II (Pol II) pause-release states. It is an important co-factor for transcription factors, such as MYC, that drive aberrant cell proliferation when their expression is deregulated. CDK9 modulation offers an approach for attenuating dysregulation in such transcriptional programs. As a result, numerous drug development campaigns to inhibit CDK9 kinase activity have been pursued. More recently, targeted degradation has emerged as an attractive approach. However, comprehensive evaluation of degradation versus inhibition is still critically needed to assess the biological contexts in which degradation might offer superior therapeutic benefits. We validated that CDK9 inhibition triggers a compensatory mechanism that dampens its effect on MYC expression and found that this feedback mechanism was absent when the kinase is degraded. Importantly, CDK9 degradation is more effective than its inhibition for disrupting MYC transcriptional regulatory circuitry likely through the abrogation of both enzymatic and scaffolding functions of CDK9. Highlights – KI-CDK9d-32 is a highly potent and selective CDK9 degrader. – KI-CDK9d-32 leads to rapid downregulation of MYC protein and mRNA transcripts levels. – KI-CDK9d-32 represses canonical MYC pathways and leads to a destabilization of nucleolar homeostasis. – Multidrug resistance ABCB1 gene emerged as the strongest resistance marker for the CDK9 PROTAC degrader.

Cultured cell lines are the workhorse of cancer research, but it is unclear to what extent they recapitulate the cellular heterogeneity observed among malignant cells in tumors, given the absence of a native tumor microenvironment. Here, we used multiplexed single cell RNA-Seq to profile ~200 cancer cell lines. We uncovered expression programs that are recurrently heterogeneous within many cancer cell lines and are largely independent of observed genetic diversity. These programs of heterogeneity are associated with diverse biological processes, including cell cycle, senescence, stress and interferon responses, epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), and protein maturation and degradation. Notably, some of these recurrent programs recapitulate those seen in human tumors, suggesting a prominent role of intrinsic plasticity in generating intra-tumoral heterogeneity. Moreover, the data allowed us to prioritize specific cell lines as model systems of cellular plasticity. We used two such models to demonstrate the dynamics, regulation and vulnerabilities associated with a cancer senescence program observed both in cell lines and in human tumors. Our work describes the landscape of cellular heterogeneity in diverse cancer cell lines, and identifies recurrent patterns of expression heterogeneity that are shared between tumors and specific cell lines and can thus be further explored in follow up studies.

Abstract Transcription factors (TFs) are key components of the aberrant transcriptional programs in cancer cells. In this study, we used TF activity (TFa), inferred from the downstream regulons as a potential biomarker to identify associated genetic vulnerabilities in cancer cells. Our linear model framework, integrating TFa and genome-wide CRISPR knockout datasets identified 1,770 candidate TFa-target pairs across different cancer types and assessed their survival impact in patient data. As a proof of concept, through inhibitor screens and genetic depletion assays in cell lines, we validated the dependency of cell lines on predicted targets linked to TEAD1, the most prominent TF from our analysis. Overall, these candidate pairs represent an attractive resource for early-stage targets and drug discovery programs in oncology.

Anti-cancer uses of non-oncology drugs have been found on occasion, but such discoveries have been serendipitous and rare. We sought to create a public resource containing the growth inhibitory activity of 4,518 drugs tested across 578 human cancer cell lines. To accomplish this, we used PRISM, which involves drug treatment of molecularly barcoded cell lines in pools. Relative barcode abundance following treatment thus reflects viability of each cell line. We found that an unexpectedly large number of non-oncology drugs selectively inhibited subsets of cancer cell lines. Moreover, the killing activity of the majority of these drugs was predictable based on the molecular features of the cell lines. Follow-up of several of these compounds revealed novel mechanisms. For example, compounds that kill by inducing PDE3A-SLFN12 complex formation; vanadium-containing compounds whose killing is dependent on the sulfate transporter SLC26A2; the alcohol dependence drug disulfiram, which kills cells with low expression of metallothioneins; and the anti-inflammatory drug tepoxalin, whose killing is dependent on high expression of the multi-drug resistance gene ABCB1. These results illustrate the potential of the PRISM drug repurposing resource as a starting point for new oncology therapeutic development. The resource is available at https://depmap.org.

A key question in genome research is whether biologically active proteins are restricted to the ~20,000 canonical, well-annotated genes, or rather extend to the many non-canonical open reading frames (ORFs) predicted by genomic analyses. To address this, we experimentally interrogated 553 ORFs nominated in ribosome profiling datasets. Of these 553 ORFs, 57 (10%) induced a viability defect when the endogenous ORF was knocked out using CRISPR/Cas9 in 8 human cancer cell lines, 257 (46%) showed evidence of protein translation when ectopically expressed in HEK293T cells, and 401 (73%) induced gene expression changes measured by transcriptional profiling following ectopic expression across 4 cell types. CRISPR tiling and start codon mutagenesis indicated that the biological effects of these non-canonical ORFs required their translation as opposed to RNA-mediated effects. We selected one of these ORFs, G029442--renamed GREP1 (Glycine-Rich Extracellular Protein-1)--for further characterization. We found that GREP1 encodes a secreted protein highly expressed in breast cancer, and its knock-out in 263 cancer cell lines showed preferential essentiality in breast cancer derived lines. Analysis of the secretome of GREP1-expressing cells showed increased abundance of the oncogenic cytokine GDF15, and GDF15 supplementation mitigated the growth inhibitory effect of GREP1 knock-out. Taken together, these experiments suggest that the non-canonical ORFeome is surprisingly rich in biologically active proteins and potential cancer therapeutic targets deserving of further study.

Summary paragraph Glucose is vital for life, serving both as a source of energy and as a carbon building block for growth. When glucose availability is limiting, alternative nutrients must be harnessed. To identify mechanisms by which cells can tolerate complete loss of glucose, we performed nutrient-sensitized, genome-wide genetic screening and growth assays of 482 pooled PRISM cancer cell lines. We report that catabolism of uridine enables the growth of cells in the complete absence of glucose. While previous studies have shown that the uracil base of uridine can be salvaged to support growth in the setting of mitochondrial electron transport chain deficiency ( 1 ), our work shows that the ribose moiety of uridine can be salvaged via a pathway we call “uridinolysis” defined as: [1] the phosphorylytic cleavage of uridine by UPP1/2 into uracil and ribose-1-phosphate (R1P), [2] the conversion of R1P into fructose-6-P and glyceraldehyde-3-P by PGM2 and the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway (non-oxPPP), and [3] their glycolytic utilization to fuel ATP production, biosynthesis and gluconeogenesis. Intriguingly, we report that uridine nucleosides derived from RNA are also a substrate for uridinolysis and that RNA can support growth in glucose-limited conditions. Our results underscore the malleability of central carbon metabolism and raise the provocative hypothesis that RNA can also serve as a potential storage for energy.