Protease-free expansion of organ-size tissue enables multiplexed super-resolution imaging of protein organization from the tissue-wide scale down through the nanoscale. The biology of multicellular organisms is coordinated across multiple size scales, from the subnanoscale of molecules to the macroscale, tissue-wide interconnectivity of cell populations. Here we introduce a method for super-resolution imaging of the multiscale organization of intact tissues. The method, called magnified analysis of the proteome (MAP), linearly expands entire organs fourfold while preserving their overall architecture and three-dimensional proteome organization. MAP is based on the observation that preventing crosslinking within and between endogenous proteins during hydrogel-tissue hybridization allows for natural expansion upon protein denaturation and dissociation. The expanded tissue preserves its protein content, its fine subcellular details, and its organ-scale intercellular connectivity. We use off-the-shelf antibodies for multiple rounds of immunolabeling and imaging of a tissue's magnified proteome, and our experiments demonstrate a success rate of 82% (100/122 antibodies tested). We show that specimen size can be reversibly modulated to image both inter-regional connections and fine synaptic architectures in the mouse brain.

ABSTRACT Microglia, the resident macrophages of the central nervous system (CNS), are dynamic cells, constantly extending and retracting their processes as they contact and functionally regulate neurons and other glial cells. There is far less known about microglia-vascular interactions, particularly under healthy steady-state conditions. Here, we use the male and female mouse cerebral cortex to show that a higher percentage of microglia associate with the vasculature during the first week of postnatal development compared to older ages and the timing of these associations are dependent on the fractalkine receptor (CX3CR1). Similar developmental microglia-vascular associations were detected in the prenatal human brain. Using live imaging in mice, we found that juxtavascular microglia migrated when microglia are actively colonizing the cortex and became stationary by adulthood to occupy the same vascular space for nearly 2 months. Further, juxtavascular microglia at all ages contact vascular areas void of astrocyte endfeet and the developmental shift in microglial migratory behavior along vessels corresponded to when astrocyte endfeet more fully ensheath vessels. Together, our data provide a comprehensive assessment of microglia-vascular interactions. They support a mechanism by which microglia use the vasculature to migrate within the developing brain parenchyma. This migration becomes restricted upon the arrival of astrocyte endfeet when juxtavascular microglia then establish a long-term, stable contact with the vasculature. SIGNIFICANCE STATEMENT We report the first extensive analysis of juxtavascular microglia in the healthy, developing and adult brain. Live imaging revealed that juxtavascular microglia within the cortex are highly motile and migrate along vessels as they are colonizing cortical regions. Using confocal, expansion, super-resolution, and electron microscopy, we determined that microglia associate with the vasculature at all ages in areas lacking full coverage astrocyte endfoot coverage and motility of juxtavascular microglia ceases as astrocyte endfeet more fully ensheath the vasculature. Our data lay the fundamental groundwork to investigate microglia-astrocyte crosstalk and juxtavascular microglial function in the healthy and diseased brain. They further provide a potential vascular-dependent mechanism by which microglia colonize the brain to later regulate neural circuit development.

Expansion microscopy (ExM) improves the resolution of fluorescence microscopy by physically expanding the sample embedded in a hydrogel[1][1]–[4][2]. Since its invention, ExM has been successfully applied to a wide range of cell, tissue and animal samples [2][3]–[9][4]. Still, fluorescence signal loss during polymerization and digestion limits molecular-scale imaging using ExM. Here we report the development of label-retention ExM (LR-ExM) with a set of trifunctional anchors that not only prevent signal loss but also enable high-efficiency protein labeling using enzymatic tags. We have demonstrated multicolor LR-ExM for a variety of subcellular structures. Combining LR-ExM with super-resolution Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), we have achieved 5 nm resolution in the visualization of polyhedral lattice of clathrin-coated pits in situ . [1]: #ref-1 [2]: #ref-4 [3]: #ref-2 [4]: #ref-9