Ubiquitination of proteins involves the concerted action of the E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzymes and E3 ubiquitin-protein ligases. It has been proposed that E3s function as 'docking proteins', specifically binding substrate proteins and specific E2s, and that ubiquitin is then transferred directly from E2s to substrates. We show here that formation of a ubiquitin thioester on E6-AP, an E3 involved in the human papillomavirus E6-induced ubiquitination of p53 (refs 6-10), is an intermediate step in E6-AP-dependent ubiquitination. The order of ubiquitin transfer is from E1 to E2, from E2 to E6-AP, and finally from E6-AP to a substrate. This cascade of ubiquitin thioester complexes suggests that E3s have a defined enzymatic activity and do not function simply as docking proteins. The cysteine residue of E6-AP responsible for ubiquitin thioester formation was mapped to a region that is highly conserved among several proteins of unknown function, suggesting that these proteins share the ability to form thioesters with ubiquitin.

Research Article1 December 1991free access A cellular protein mediates association of p53 with the E6 oncoprotein of human papillomavirus types 16 or 18. J.M. Huibregtse J.M. Huibregtse Laboratory of Tumor Virus Biology, National Cancer Institute, Bethesda, MD 20892. Search for more papers by this author M. Scheffner M. Scheffner Laboratory of Tumor Virus Biology, National Cancer Institute, Bethesda, MD 20892. Search for more papers by this author P.M. Howley P.M. Howley Laboratory of Tumor Virus Biology, National Cancer Institute, Bethesda, MD 20892. Search for more papers by this author J.M. Huibregtse J.M. Huibregtse Laboratory of Tumor Virus Biology, National Cancer Institute, Bethesda, MD 20892. Search for more papers by this author M. Scheffner M. Scheffner Laboratory of Tumor Virus Biology, National Cancer Institute, Bethesda, MD 20892. Search for more papers by this author P.M. Howley P.M. Howley Laboratory of Tumor Virus Biology, National Cancer Institute, Bethesda, MD 20892. Search for more papers by this author Author Information J.M. Huibregtse1, M. Scheffner1 and P.M. Howley1 1Laboratory of Tumor Virus Biology, National Cancer Institute, Bethesda, MD 20892. The EMBO Journal (1991)10:4129-4135https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1991.tb04990.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The E6 protein of human papillomavirus types 16 and 18 (HPV-16 and HPV-18) can stably associate with the p53 protein in vitro. In the presence of rabbit reticulocyte lysate, this association leads to the specific degradation of p53 through the ubiquitin-dependent proteolysis system. We have examined the E6-p53 complex in more detail and have found that association of E6 with p53 is mediated by an additional cellular factor. This factor is present in rabbit reticulocyte lysate, primary human keratinocytes and in each of five human cell lines examined. The factor is designated E6-AP, for E6-associated protein, based on the observation that the E6 proteins of HPV-16 and 18 can form a stable complex with the factor in the absence of p53, whereas p53 association with the factor can be detected only in the presence of E6. Gel filtration and coprecipitation experiments indicate that E6-AP is a monomeric protein of approximately 100 kDa. Previous ArticleNext Article Volume 10Issue 131 December 1991In this issue RelatedDetailsLoading ...

The E6AP ubiquitin-protein ligase (E3) mediates the human papillomavirus-induced degradation of the p53 tumor suppressor in cervical cancer and is mutated in Angelman syndrome, a neurological disorder. The crystal structure of the catalytic hect domain of E6AP reveals a bilobal structure with a broad catalytic cleft at the junction of the two lobes. The cleft consists of conserved residues whose mutation interferes with ubiquitin-thioester bond formation and is the site of Angelman syndrome mutations. The crystal structure of the E6AP hect domain bound to the UbcH7 ubiquitin-conjugating enzyme (E2) reveals the determinants of E2-E3 specificity and provides insights into the transfer of ubiquitin from the E2 to the E3.

Tuberculosis Vaccine Conundrum Some children experience severe clinical disease when they are vaccinated against tuberculosis, an attenuated live vaccine that is normally innocuous in humans. Several germline mutations have been identified that account for this susceptibility, and now Bogunovic et al. (p. 1684 , published online 2 August) add another to the list— ISG15 . Uncovering this mutation, which is inherited in an autosomal recessive manner, was a surprise because studies with mice deficient in ISG15 showed enhanced susceptibility to some viral, but not bacterial, infections. Nevertheless, patients lacking ISG15 were not able to produce adequate amounts of interferon-γ, a cytokine critical for clearance of the bacteria.

VP40, the putative matrix protein of both Ebola and Marburg viruses, possesses a conserved proline-rich motif (PY motif) at its N terminus. We demonstrate that the VP40 protein can mediate its own release from mammalian cells, and that the PY motif is important for this self-exocytosis (budding) function. In addition, we used Western-ligand blotting to demonstrate that the PY motif of VP40 can mediate interactions with specific cellular proteins that have type I WW-domains, including the mammalian ubiquitin ligase, Nedd4. Single point mutations that disrupted the PY motif of VP40 abolished the PY/WW-domain interactions. Significantly, the full-length VP40 protein was shown to interact both physically and functionally with full-length Rsp5, a ubiquitin ligase of yeast and homolog of Nedd4. The VP40 protein was multiubiquitinated by Rsp5 in a PY-dependent manner in an in vitro ubiquitination assay. These data demonstrate that the VP40 protein of Ebola virus possesses a PY motif that is functionally similar to those described previously for Gag and M proteins of specific retroviruses and rhabdoviruses, respectively. Last, these studies imply that VP40 likely plays an important role in filovirus budding, and that budding of retroviruses, rhabdoviruses, and filoviruses may proceed via analogous mechanisms.

IFN-α/β plays an essential role in innate immunity against viral and bacterial infection. Among the proteins induced by IFN-α/β are the ubiquitin-like ISG15 protein and its E1- (Ube1L) and E2- (UbcH8) conjugating enzymes, leading to the conjugation of ISG15 to cellular proteins. It is likely that ISG15 conjugation plays an important role in antiviral response because a human virus, influenza B virus, inhibits ISG15 conjugation. However, the biological function of ISG15 modification remains unknown, largely because only a few human ISG15 target proteins have been identified. Here we purify ISG15-modified proteins from IFN-β-treated human (HeLa) cells by using double-affinity selection and use mass spectroscopy to identify a large number (158) of ISG15 target proteins. Eight of these proteins were subjected to further analysis and verified to be ISG15 modified in IFN-β-treated cells, increasing the likelihood that most, if not all, targets identified by mass spectroscopy are bona fide ISG15 targets. Several of the targets are IFN-α/β-induced antiviral proteins, including PKR, MxA, HuP56, and RIG-I, providing a rationale for the inhibition of ISG15 conjugation by influenza B virus. Most targets are constitutively expressed proteins that function in diverse cellular pathways, including RNA splicing, chromatin remodeling/polymerase II transcription, cytoskeleton organization and regulation, stress responses, and translation. These results indicate that ISG15 conjugation impacts nuclear as well as cytoplasmic functions. By targeting a wide array of constitutively expressed proteins, ISG15 conjugation greatly extends the repertoire of cellular functions that are affected by IFN-α/β.

AbstractThe high-risk human papillomavirus (HPV) E6 proteins stimulate the ubiquitination and degradation of p53, dependent on the E6AP ubiquitin-protein ligase. Other proteins have also been shown to be targeted for degradation by E6, including hDlg, the human homolog of the Drosophila melanogaster Discs large (Dlg) tumor suppressor. We show here that the human homolog of the Drosophila Scribble (Vartul) (hScrib) tumor suppressor protein is also targeted for ubiquitination by the E6-E6AP complex in vitro and that expression of E6 induces degradation of hScrib in vivo. Characterization of the E6AP-E6-hScrib complex indicated that hScrib binds directly to E6 and that the binding is mediated by the PDZ domains of hScrib and a carboxyl-terminal epitope conserved among the high-risk HPV E6 proteins. Green fluorescent protein-hScrib was localized to the periphery of MDCK cells, where it colocalized with ZO-1, a component of tight junctions. E6 expression resulted in loss of integrity of tight junctions, as measured by ZO-1 localization, and this effect was dependent on the PDZ binding epitope of E6. Thus, the high-risk HPV E6 proteins induce the degradation of the human homologs of two Drosophila PDZ domain-containing tumor suppressor proteins, hDlg and hScrib, both of which are associated with cell junction complexes. The fact that Scrib/Vart and Dlg appear to cooperate in a pathway that controls Drosophila epithelial cell growth suggests that the combined targeting of hScrib and hDlg is an important component of the biologic activity of high-risk HPV E6 proteins. ACKNOWLEDGMENTSThis work was supported by a grant to J.M.H. from the National Institutes of Health (CA72943), and S.N. was supported by a fellowship from the University of Tokyo, Faculty of Medicine, and the Kanzawa Medical Research Foundation.We thank Bernard Mechler for communication of unpublished results, members of our laboratory for helpful discussions, Sylvie Beaudenon for generation and characterization of HPV39 E6 baculovirus, the Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan, for providing cDNA for KIAA0147, and Go Totsukawa, Fumio Matsumura, and Herb Geller and the Robert Wood Johnson Medical School Confocal and Electronic Imaging Center for assistance with microscopy and image analysis.

E6-AP is a 100-kDa cellular protein that mediates the interaction of the human papillomavirus type 16 and 18 E6 proteins with p53. The association of p53 with E6 and E6-AP promotes the specific ubiquitination and subsequent proteolytic degradation of p53 in vitro. We recently isolated a cDNA encoding E6-AP and have now mapped functional domains of E6-AP involved in binding E6, association with p53, and ubiquitination of p53. The E6 binding domain consists of an 18-amino-acid region within the central portion of the molecule. Deletion of these 18 amino acids from E6-AP results in loss of both E6 and p53 binding activities. The region that directs p53 binding spans the E6 binding domain and consists of approximately 500 amino acids. E6-AP sequences in addition to those required for formation of a stable ternary complex with E6 and p53 are necessary to stimulate the ubiquitination of p53. These sequences lie within the C-terminal 84 amino acids of E6-AP. The entire region required for E6-dependent ubiquitination of p53 is also required for the ubiquitination of an artificial E6 fusion protein.