Abstract Evaluating the quality of a de novo annotation of a complex fungal genome based on RNA-seq data remains a challenge. In this study, we sequentially optimized a Cufflinks-CodingQuary based bioinformatics pipeline fed with RNA-seq data using the manually annotated model pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Cryptococcus deneoformans as test cases. Our results demonstrate that the quality of the annotation is sensitive to the quantity of RNA-seq data used and that the best quality is obtained with 5 to 10 million reads per RNA-seq replicate. We also demonstrated that the number of introns predicted is an excellent a priori indicator of the quality of the final de novo annotation. We then used this pipeline to annotate the genome of the RNAi-deficient species Cryptococcus deuterogattii strain R265 using RNA-seq data. Dynamic transcriptome analysis revealed that intron retention is more prominent in C. deuterogattii than in the other RNAi-proficient species C. neoformans and C. deneoformans . In contrast, we observed that antisense transcription was not higher in C. deuterogattii than in the two other Cryptococcus species. Comparative gene content analysis identified 21 clusters enriched in transcription factors and transporters that have been lost. Interestingly, analysis of the subtelomeric regions in these three annotated species identified a similar gene enrichment, reminiscent of the structure of primary metabolic clusters. Our data suggest that there is active exchange between subtelomeric regions, and that other chromosomal regions might participate in adaptive diversification of Cryptococcus metabolite assimilation potential.

Regular protocols for the isolation of fungal extracellular vesicles (EVs) are time-consuming, hard to reproduce, and produce low yields. In an attempt to improve the protocols used for EV isolation, we explored a model of vesicle production after growth of Cryptococcus gattiiandC. neoformanson solid media. Nanoparticle tracking analysis in combination with transmission electron microscopy revealed that C. gattiiandC. neoformansproduced EVs in solid media. These results were reproduced with an acapsular mutant of C. neoformans, as well as with isolates of Candida albicans, Histoplasma capsulatum, andSaccharomyces cerevisiae. Cryptococcal EVs produced in solid media were biologically active and contained regular vesicular components, including the major polysaccharide glucuronoxylomannan (GXM) and RNA. Since the protocol had higher yields and was much faster than the regular methods used for the isolation of fungal EVs, we asked if it would be applicable to address fundamental questions related to cryptococcal secretion. On the basis that polysaccharide export in Cryptococcusrequires highly organized membrane traffic culminating with EV release, we analyzed the participation of a putative scramblase (Aim25, CNBG_3981) in EV-mediated GXM export and capsule formation in C. gattii. EVs from a C. gattiiaim25Dstrain differed from those obtained from wild-type (WT) cells in physical-chemical properties and cargo. In a model of surface coating of an acapsular cryptococcal strain with vesicular GXM, EVs obtained from the aim25Dmutant were more efficiently used as a source of capsular polysaccharides. Lack of the Aim25 scramblase resulted in disorganized membranes and increased capsular dimensions. These results associate the description of a novel protocol for the isolation of fungal EVs with the identification of a previously unknown regulator of polysaccharide release.

Abstract While the Coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic is altering academia dynamics, those juggling remote work and domestic demands – including childcare - have already felt the impacts on productivity. Female authors are facing a decrease in papers submission rates since the beginning of the pandemic period. The reasons for this decline in women productivity need to be further investigated. Here we show the influence of gender, parenthood and race in academics productivity during the pandemic period, based on a survey answered by 3,345 Brazilian academics from various knowledge areas and research institutions. Findings revealed that male academics - especially childless ones - were the least affected group, whereas female academics, especially Black women and mothers, were the most impacted group. This scenario will leave long-term effects on the career progression of the most affected groups. The results presented here are crucial for the development of actions and policies that aim to avoid further deepening the gender gap in science. This particular situation we are facing during the pandemic demands institutional flexibility and academia should foster the discussion about actions to benefit Black scientists and academics with families in the post-pandemic scenario.

Abstract Small molecules are components of fungal extracellular vesicles (EVs), but their biological roles are only superficially known. NOP16 is a eukaryotic gene that is required for the activity of benzimidazoles against Cryptococcus deuterogattii . In this study, during the phenotypic characterization of C. deuterogattii mutants lacking NOP16 expression, we observed that this gene was required for EV production. Analysis of the small molecule composition of EVs produced by wild-type cells and two independent nop16 Δ mutants revealed that the deletion of NOP16 resulted not only in a reduced number of EVs but also an altered small molecule composition. In a Galleria mellonella model of infection, the nop16 Δ mutants were hypovirulent. The hypovirulent phenotype was reverted when EVs produced by wild-type cells, but not mutant EVs, were co-injected with the nop16 Δ cells in G. mellonella . These results reveal a role for NOP16 in EV biogenesis and cargo, and also indicate that the composition of EVs is determinant for cryptococcal virulence.

Abstract Intracellular calcium (Ca 2+ ) is crucial for signal transduction in Cryptococcus neoformans , the major cause of fatal fungal meningitis. The calcineurin pathway is the only Ca 2+ -requiring signalling cascade implicated in cryptococcal stress adaptation and virulence, with Ca 2+ -binding mediated by the EF-hand domains of the Ca 2+ sensor protein calmodulin. In this study, we identified the cryptococcal ortholog of neuronal calcium sensor-1 (Ncs1) as a member of the EF-hand superfamily. We demonstrated that Ncs1 has a role in Ca 2+ homeostasis under stress and non-stress conditions, as the ncs1Δ mutant is sensitive to a high Ca 2+ concentration and has an elevated basal Ca 2+ level that correlates with increased expression of the Ca 2+ transporter genes, CCH1 and MID1 . Furthermore, NCS1 expression is induced by Ca 2+ , with the Ncs1 protein adopting a punctate subcellular distribution. We also demonstrate that, in contrast to Saccharomyces cerevisiae , NCS1 expression in C. neoformans is regulated by the calcineurin pathway via the transcription factor Crz1, as NCS1 expression is reduced by FK506 treatment and CRZ1 deletion. Moreover, the ncs1Δ mutant shares a high temperature and high Ca 2+ sensitivity phenotype with the calcineurin and calmodulin mutants ( cna1 Δ and cam1Δ ) and the NCS1 promoter contains two calcineurin/Crz1-dependent response elements (CDRE1). Ncs1-deficency coincided with reduced growth, characterized by delayed bud emergence and aberrant cell division, and hypovirulence in a mouse infection model. In summary, our data shows that Ncs1 plays distinct roles in Ca 2+ sensing in C. neoformans despite widespread functional conservation of Ncs1 and other regulators of Ca 2+ homeostasis. Importance Cryptococcus neoformans is the major cause of fungal meningitis in HIV infected patients. Several studies have highlighted the important contribution of Ca 2+ signalling and homeostasis to the virulence of C. neoformans . Here, we identify the cryptococcal ortholog of neuronal calcium sensor-1 (Ncs1) and demonstrate its role in Ca 2+ homeostasis, bud emergence, cell cycle progression and virulence. We also show that Ncs1 function is regulated by the calcineurin/Crz1 signalling cascade. Our work provides evidence of a link between Ca 2+ homeostasis and cell cycle progression in C. neoformans .