Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based lipidomics has been a subject of dramatic developments over the past decade. This review focuses on state of the art in LC-MS-based lipidomics, covering all the steps of global lipidomic profiling. On the basis of review of 185 original papers and application notes, we can conclude that typical LC-MS-based lipidomics methods involve: (1) extraction using chloroform/MeOH or MTBE/MeOH protocols, both with addition of internal standards covering each lipid class; (2) separation of lipids using short microbore columns with sub-2-μm or 2.6-2.8-μm (fused-core) particle size with C18 or C8 sorbent with analysis time <30 min; (3) electrospray ionization in positive- and negative-ion modes with full spectra acquisition using high-resolution MS with capability to MS/MS. Phospholipids (phosphatidylcholines, phosphatidylethanolamines, phosphatidylinositols, phosphatidylserines, phosphatidylglycerols) followed by sphingomyelins, di- and tri-acylglycerols, and ceramides were the most frequently targeted lipid species.

Compound identification from accurate mass MS/MS spectra is a bottleneck for untargeted metabolomics. In this study, we propose nine rules of hydrogen rearrangement (HR) during bond cleavages in low-energy collision-induced dissociation (CID). These rules are based on the classic even-electron rule and cover heteroatoms and multistage fragmentation. We evaluated our HR rules by the statistics of MassBank MS/MS spectra in addition to enthalpy calculations, yielding three levels of computational MS/MS annotation: "resolved" (regular HR behavior following HR rules), "semiresolved" (irregular HR behavior), and "formula-assigned" (lacking structure assignment). With this nomenclature, 78.4% of a total of 18506 MS/MS fragment ions in the MassBank database and 84.8% of a total of 36370 MS/MS fragment ions in the GNPS database were (semi-) resolved by predicted bond cleavages. We also introduce the MS-FINDER software for structure elucidation. Molecular formulas of precursor ions are determined from accurate mass, isotope ratio, and product ion information. All isomer structures of the predicted formula are retrieved from metabolome databases, and MS/MS fragmentations are predicted in silico. The structures are ranked by a combined weighting score considering bond dissociation energies, mass accuracies, fragment linkages, and, most importantly, nine HR rules. The program was validated by its ability to correctly calculate molecular formulas with 98.0% accuracy for 5063 MassBank MS/MS records and to yield the correct structural isomer with 82.1% accuracy within the top-3 candidates. In a test with 936 manually identified spectra from an untargeted HILIC-QTOF MS data set of human plasma, formulas were correctly predicted in 90.4% of the cases, and the correct isomer structure was retrieved at 80.4% probability within the top-3 candidates, including for compounds that were absent in mass spectral libraries. The MS-FINDER software is freely available at http://prime.psc.riken.jp/.

Using untargeted metabolomics (n = 1,162 subjects), the plasma metabolite (m/z = 265.1188) phenylacetylglutamine (PAGln) was discovered and then shown in an independent cohort (n = 4,000 subjects) to be associated with cardiovascular disease (CVD) and incident major adverse cardiovascular events (myocardial infarction, stroke, or death). A gut microbiota-derived metabolite, PAGln, was shown to enhance platelet activation-related phenotypes and thrombosis potential in whole blood, isolated platelets, and animal models of arterial injury. Functional and genetic engineering studies with human commensals, coupled with microbial colonization of germ-free mice, showed the microbial porA gene facilitates dietary phenylalanine conversion into phenylacetic acid, with subsequent host generation of PAGln and phenylacetylglycine (PAGly) fostering platelet responsiveness and thrombosis potential. Both gain- and loss-of-function studies employing genetic and pharmacological tools reveal PAGln mediates cellular events through G-protein coupled receptors, including α2A, α2B, and β2-adrenergic receptors. PAGln thus represents a new CVD-promoting gut microbiota-dependent metabolite that signals via adrenergic receptors.Video AbstracteyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiI1Y2Q0ZGZhMTNjOWZjODc1ZmQwODJkN2ZhMGZjY2M4OSIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjc4NTMyOTIxfQ.A7ok2qU77Vr0vgq8j1GPEn0w0uDprE84fuTG3Odr3YHzobK5z0XznViS5PD96VB3Dg1F02Gv-jBxQH-IXc8fryspRQcWNm2KBxypipWF8UeKgaKtAZfye0cRomFeYI5_Iza4mBs9260GDGX112uiizfXMLf_IQV742wepwhstcvKhiq9f2ovi9mQArvBrCO1TWP_-dAEEJO2FElitNSRqkmvZoRQJHwiANR-XGDBdqjQ3ogtfKipDUdkSYz0-BZT29l1rCYWxFY_0S1QDnxc0CZVjuhacEiFOWfmCVZVBIETFqZFE3xtqoqmPQqW80ki4DBLK5KB6xG7plHLvP9i2w(mp4, (36.03 MB) Download video

As the lipidomics field continues to advance, self-evaluation within the community is critical. Here, we performed an interlaboratory comparison exercise for lipidomics using Standard Reference Material (SRM) 1950-Metabolites in Frozen Human Plasma, a commercially available reference material. The interlaboratory study comprised 31 diverse laboratories, with each laboratory using a different lipidomics workflow. A total of 1,527 unique lipids were measured across all laboratories and consensus location estimates and associated uncertainties were determined for 339 of these lipids measured at the sum composition level by five or more participating laboratories. These evaluated lipids detected in SRM 1950 serve as community-wide benchmarks for intra- and interlaboratory quality control and method validation. These analyses were performed using nonstandardized laboratory-independent workflows. The consensus locations were also compared with a previous examination of SRM 1950 by the LIPID MAPS consortium. While the central theme of the interlaboratory study was to provide values to help harmonize lipids, lipid mediators, and precursor measurements across the community, it was also initiated to stimulate a discussion regarding areas in need of improvement.

Direct analysis in real time (DART) is an ambient ionization technique undergoing rapid development. With minimal sample pre-treatment, ionization of analyte molecules outside the mass spectrometry (MS) instrument in the ordinary atmosphere is feasible. This ionization approach relies upon the fundamental principles of atmospheric pressure chemical ionization. The current review highlights and critically assesses application of DART (and some related desorption/ionization techniques) coupled to various types of MS analyzers for both target and non-target analysis of complex food matrices. Based on existing studies, DART-MS is presented as a simple, high-throughput tool for: qualitative confirmation of chemical identity; metabolomic fingerprinting/profiling; and, quantification of low-molecular-weight food components, including some trace organic contaminants. With regard to regulatory requirements, we mention practical aspects of DART-MS use, as well as performance characteristics that can be attained.

Large-scale untargeted lipidomics experiments involve the measurement of hundreds to thousands of samples. Such data sets are usually acquired on one instrument over days or weeks of analysis time. Such extensive data acquisition processes introduce a variety of systematic errors, including batch differences, longitudinal drifts, or even instrument-to-instrument variation. Technical data variance can obscure the true biological signal and hinder biological discoveries. To combat this issue, we present a novel normalization approach based on using quality control pool samples (QC). This method is called systematic error removal using random forest (SERRF) for eliminating the unwanted systematic variations in large sample sets. We compared SERRF with 15 other commonly used normalization methods using six lipidomics data sets from three large cohort studies (832, 1162, and 2696 samples). SERRF reduced the average technical errors for these data sets to 5% relative standard deviation. We conclude that SERRF outperforms other existing methods and can significantly reduce the unwanted systematic variation, revealing biological variance of interest.

Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) methods are most often used for untargeted metabolomics and lipidomics. However, methods have not been standardized as accepted "best practice" documents, and reports lack harmonization with respect to quantitative data that enable interstudy comparisons. Researchers use a wide variety of high-resolution mass spectrometers under different operating conditions, and it is unclear if results would yield different biological conclusions depending on the instrument performance. To this end, we used 126 identical human plasma samples and 29 quality control samples from a nutritional intervention study. We investigated lipidomic data acquisitions across nine different MS instruments (1 single TOF, 1 Q/orbital ion trap, and 7 QTOF instruments). Sample preparations, chromatography conditions, and data processing methods were kept identical. Single-point internal standard calibrations were used to estimate absolute concentrations for 307 unique lipids identified by accurate mass, MS/MS spectral match, and retention times. Quantitative results were highly comparable between the LC–MS platforms tested. Using partial least-squares discriminant analysis (PLS-DA) to compare results between platforms, a 92% overlap for the most discriminating lipids based on variable importance in projection (VIP) scores was achieved for all lipids that were detected by at least two instrument platforms. Importantly, even the relative positions of individual samples on the PLS-DA projections were identical. The key for success in harmonizing results was to avoid ion saturation by carefully evaluating linear dynamic ranges using serial dilutions and adjusting the resuspension volume and/or injection volume before running actual study samples.

Contrast-enhanced computed tomography offers a nondestructive approach to studying adipose tissue in 3D. Several contrast-enhancing staining agents (CESAs) have been explored, whereof osmium tetroxide (OsO