Abstract In a side-by-side comparison of evolutionary dynamics between the 2019/2020 SARS-CoV-2 and the 2003 SARS-CoV, we were surprised to find that SARS-CoV-2 resembles SARS-CoV in the late phase of the 2003 epidemic after SARS-CoV had developed several advantageous adaptations for human transmission. Our observations suggest that by the time SARS-CoV-2 was first detected in late 2019, it was already pre-adapted to human transmission to an extent similar to late epidemic SARS-CoV. However, no precursors or branches of evolution stemming from a less human-adapted SARS-CoV-2-like virus have been detected. The sudden appearance of a highly infectious SARS-CoV-2 presents a major cause for concern that should motivate stronger international efforts to identify the source and prevent near future re-emergence. Any existing pools of SARS-CoV-2 progenitors would be particularly dangerous if similarly well adapted for human transmission. To look for clues regarding intermediate hosts, we analyze recent key findings relating to how SARS-CoV-2 could have evolved and adapted for human transmission, and examine the environmental samples from the Wuhan Huanan seafood market. Importantly, the market samples are genetically identical to human SARS-CoV-2 isolates and were therefore most likely from human sources. We conclude by describing and advocating for measured and effective approaches implemented in the 2002-2004 SARS outbreaks to identify lingering population(s) of progenitor virus.

COVID-19 CG is an open resource for tracking SARS-CoV-2 single-nucleotide variations (SNVs) and lineages while filtering by location, date, gene, and mutation of interest. COVID-19 CG provides significant time, labor, and cost-saving utility to diverse projects on SARS-CoV-2 transmission, evolution, emergence, immune interactions, diagnostics, therapeutics, vaccines, and intervention tracking. Here, we describe case studies in which users can interrogate (1) SNVs in the SARS-CoV-2 Spike receptor binding domain (RBD) across different geographic regions to inform the design and testing of therapeutics, (2) SNVs that may impact the sensitivity of commonly used diagnostic primers, and (3) the recent emergence of a dominant lineage harboring an S477N RBD mutation in Australia. To accelerate COVID-19 research and public health efforts, COVID-19 CG will be continually upgraded with new features for users to quickly and reliably pinpoint mutations as the virus evolves throughout the pandemic and in response to therapeutic and public health interventions.

Abstract Multiple publications have independently described pangolin CoV genomes from the same batch of smuggled pangolins confiscated in Guangdong province in March, 2019. We analyzed the three metagenomic datasets that sampled this batch of pangolins and found that the two complete pangolin CoV genomes, GD_1 by Xiao et al. Nature and MP789 by Liu et al. PLoS Pathogens , were both built primarily using the 2019 dataset first described by Liu et al. Viruses . Other publications, such as Zhang et al. Current Biology and Lam et al. Nature , have also relied on this same dataset by Liu et al. Viruses for their assembly of the Guangdong pangolin CoV sequences and comparisons to SARS-CoV-2. To our knowledge, all of the published pangolin CoV genome sequences that share a highly similar Spike receptor binding domain with SARS-CoV-2 originate from this singular batch of smuggled pangolins. This raises the question of whether pangolins are truly reservoirs or hosts of SARS-CoV-2-related coronaviruses in the wild, or whether the pangolins may have contracted the CoV from another host species during trafficking. Our observations highlight the importance of requiring authors to publish their complete genome assembly pipeline and all contributing raw sequence data, particularly those supporting epidemiological investigations, in order to empower peer review and independent analysis of the sequence data. This is necessary to ensure both the accuracy of the data and the conclusions presented by each publication.

Abstract Viruses have evolved the ability to bind and enter cells through interactions with a wide variety of host cell macromolecules. Here, we screened for AAV capsids that bind two host cell proteins expressed on the mouse blood-brain barrier, LY6A or the related protein LY6C1. Introducing interactions with either protein target generated hundreds of capsids with dramatically enhanced central nervous system (CNS) tropisms. In contrast to the AAV-PHP.B capsid family, which interacts with LY6A and only exhibits its enhanced CNS tropism in a subset of mouse strains, the capsids that engage LY6C1 maintain their CNS tropism in BALB/cJ mice. Compared to conventional in vivo screens for CNS cell transducing capsids, a single round of protein target binding screening recovered significantly more capsids with enhanced performance that were validated in subsequent in vivo screens. Moreover, the initial screening round generated reproducible and quantitative target binding data that enabled the efficient machine learning-guided generation of more diverse targetspecific capsids. This work demonstrates that AAV capsids can be directly targeted to specific proteins to generate potent gene delivery vectors with known mechanisms of action and predictable tropisms.

Abstract Representational biases that are common in biological data can inflate prediction performance and confound our understanding of how and what machine learning (ML) models learn from large complicated datasets. However, auditing for these biases is not a common practice in ML in the life sciences. Here, we devise a systematic auditing framework and harness it to audit three different ML applications of significant therapeutic interest: prediction frameworks of protein-protein interactions, drug-target bioactivity, and MHC-peptide binding. Through this, we identify unrecognized biases that hinder the ML process and result in low model generalizability. Ultimately, we show that, when there is insufficient signal in the training data, ML models are likely to learn primarily from representational biases.

Abstract Broadening gene therapy applications requires manufacturable vectors that efficiently transduce target cells in humans and preclinical models. Conventional selections of adeno-associated virus (AAV) capsid libraries are inefficient at searching the vast sequence space for the small fraction of vectors possessing multiple traits essential for clinical translation. Here, we present Fit4Function, a generalizable machine learning (ML) approach for systematically engineering multi-trait AAV capsids. By leveraging a capsid library that uniformly samples the manufacturable sequence space, reproducible screening data are generated to train accurate sequence-to-function models. Combining six models, we designed a multi-trait (liver-targeted, manufacturable) capsid library and validated 88% of library variants on all six predetermined criteria. Furthermore, the models, trained only on mouse in vivo and human in vitro Fit4Function data, accurately predicted AAV capsid variant biodistribution in macaque. Top candidates exhibited production yields comparable to AAV9, efficient murine liver transduction, up to 1000-fold greater human hepatocyte transduction, and increased enrichment relative to AAV9 in a screen for liver transduction in macaques. The Fit4Function strategy ultimately makes it possible to predict cross-species traits of peptide-modified AAV capsids and is a critical step toward assembling an ML atlas that predicts AAV capsid performance across dozens of traits.

Abstract Broadening gene therapy applications requires manufacturable vectors that efficiently transduce target cells in humans and preclinical models. Conventional selections of adeno-associated virus (AAV) capsid libraries are inefficient at searching the vast sequence space for the small fraction of vectors possessing multiple traits essential for clinical translation. Here, we present Fit4Function, a generalizable machine learning (ML) approach for systematically engineering multi-trait AAV capsids. By leveraging a capsid library that evenly samples the manufacturable sequence space, reproducible screening data are generated to train accurate sequence-to-function models. Combining six models, we designed a multi-trait (liver-targeted, manufacturable) capsid library and validated 89% of library variants on all six predetermined criteria. Furthermore, the models, trained only on mouse in vivo and human in vitro Fit4Function data, accurately predicted AAV capsid variant biodistribution in macaque. Top candidates exhibited high production yields, efficient murine liver transduction, up to 1000-fold greater human hepatocyte transduction, and increased enrichment, relative to AAV9, in a screen for liver transduction in macaques. The Fit4Function strategy ultimately makes it possible to predict cross-species traits of peptide-modified AAV capsids and is a critical step toward assembling an ML atlas that predicts AAV capsid performance across dozens of traits.

Developing vehicles that efficiently deliver genes throughout the human central nervous system (CNS) will broaden the range of treatable genetic diseases. We engineered an AAV capsid, BI-hTFR1, that binds human Transferrin Receptor (TfR1), a protein expressed on the blood-brain barrier (BBB). BI-hTFR1 was actively transported across a human brain endothelial cell layer and, relative to AAV9, provided 40-50 times greater reporter expression in the CNS of human TFRC knock-in mice. The enhanced tropism was CNS-specific and absent in wild type mice. When used to deliver GBA1, mutations of which cause Gaucher disease and are linked to Parkinson9s disease, BI-hTFR1 substantially increased brain and cerebrospinal fluid glucocerebrosidase activity compared to AAV9. These findings establish BI-hTFR1 as a promising vector for human CNS gene therapy.

The engineered AAV-PHP.B family of adeno-associated virus efficiently delivers genes throughout the mouse central nervous system. To guide their application across disease models, and to inspire the development of translational gene therapy vectors useful for targeting neurological diseases in humans, we sought to elucidate the host factors responsible for the CNS tropism of AAV-PHP.B vectors. Leveraging CNS tropism differences across mouse strains, we conducted a genome-wide association study, and rapidly identified and verified LY6A as an essential receptor for the AAV-PHP.B vectors in brain endothelial cells. Importantly, this newly discovered mode of AAV binding and transduction is independent of other known AAV receptors and can be imported into different cell types to confer enhanced transduction by the AAV-PHP.B vectors.

Ectopic R-loop accumulation causes DNA replication stress and genome instability. To avoid these outcomes, cells possess a range of anti-R-loop mechanisms, including RNaseH that degrades the RNA moiety in R-loops. To comprehensively identify anti-R-loop mechanisms, we performed a genome-wide trigenic interaction screen in yeast lacking RNH1 and RNH201. We identified >100 genes critical for fitness in the absence of RNaseH, which were enriched for DNA replication fork maintenance factors such as RAD50. We show in yeast and human cells that R-loops accumulate during RAD50 depletion. In human cancer cell models, we find that RAD50 and its partners in the MRE11-RAD50-NBS1 complex regulate R-loop-associated DNA damage and replication stress. We show that a non-nucleolytic function of MRE11 is important for R-loop suppression via activation of PCNA-ubiquitination by RAD18 and recruiting anti-R-loop helicases in the Fanconi Anemia pathway. This work establishes a novel role for MRE11-RAD50-NBS1 in directing tolerance mechanisms of transcription-replication conflicts.