Most proteins for structural biology studies are produced by high-level expression in Escherichia coli. However, prokaryotic based expression systems fail to generate correctly folded functional forms of many proteins and hence a variety of eukaryotic based expression systems have been developed. Of these, yeast and baculovirus-infected insect cells currently represent the expression systems of choice for structural biologists. Here, protocols for a simple, fast and affordable method for transient protein expression in mammalian cells are reported. The results demonstrate that it combines several features necessary for the production of suitable samples for structural biology, in particular protein crystallography, namely high protein yield, straightforward purification, selenomethionine incorporation and control of N-linked glycosylation. The system is suitable for use in conventional laboratories or can be implemented in a medium- or high-throughput pipeline.

The three-dimensional positions of atoms in protein molecules define their structure and their roles in biological processes. The more precisely atomic coordinates are determined, the more chemical information can be derived and the more mechanistic insights into protein function may be inferred. Electron cryo-microscopy (cryo-EM) single-particle analysis has yielded protein structures with increasing levels of detail in recent years1,2. However, it has proved difficult to obtain cryo-EM reconstructions with sufficient resolution to visualize individual atoms in proteins. Here we use a new electron source, energy filter and camera to obtain a 1.7 Å resolution cryo-EM reconstruction for a human membrane protein, the β3 GABAA receptor homopentamer3. Such maps allow a detailed understanding of small-molecule coordination, visualization of solvent molecules and alternative conformations for multiple amino acids, and unambiguous building of ordered acidic side chains and glycans. Applied to mouse apoferritin, our strategy led to a 1.22 Å resolution reconstruction that offers a genuine atomic-resolution view of a protein molecule using single-particle cryo-EM. Moreover, the scattering potential from many hydrogen atoms can be visualized in difference maps, allowing a direct analysis of hydrogen-bonding networks. Our technological advances, combined with further approaches to accelerate data acquisition and improve sample quality, provide a route towards routine application of cryo-EM in high-throughput screening of small molecule modulators and structure-based drug discovery. Advances in electron cryo-microscopy hardware allow proteins to be studied at atomic resolution.

Type-A γ-aminobutyric acid receptors (GABAARs) are the principal mediators of rapid inhibitory synaptic transmission in the human brain. A decline in GABAAR signalling triggers hyperactive neurological disorders such as insomnia, anxiety and epilepsy. Here we present the first three-dimensional structure of a GABAAR, the human β3 homopentamer, at 3 Å resolution. This structure reveals architectural elements unique to eukaryotic Cys-loop receptors, explains the mechanistic consequences of multiple human disease mutations and shows an unexpected structural role for a conserved N-linked glycan. The receptor was crystallized bound to a previously unknown agonist, benzamidine, opening a new avenue for the rational design of GABAAR modulators. The channel region forms a closed gate at the base of the pore, representative of a desensitized state. These results offer new insights into the signalling mechanisms of pentameric ligand-gated ion channels and enhance current understanding of GABAergic neurotransmission. GABAA receptors are the principal mediators of rapid inhibitor synaptic transmission in the brain, and a decline in GABAA signalling leads to diseases including epilepsy, insomnia, anxiety and autism; here, the first X-ray crystal structure of a human GABAA receptor, the human β3 homopentamer, reveals structural features unique for this receptor class and uncovers the locations of key disease-causing mutations. Paul Miller and Radu Aricescu report the first X-ray crystal structure of the human GABAA receptor, a pentameric ligand-gated ion channel and the principal mediator of rapid inhibitory synaptic transmission in the brain. The overall structure resembles those of other Cys-loop receptors but there are also several unique features, including the presence of an extended glycan sheath that would restrict interactions with other synaptic proteins. The authors discuss how specific mutations may be linked to specific diseases, and since the structure was obtained in the presence of benzamidine, a GABAA receptor agonist, it is hoped that this work could contribute to the design of new therapeutic agents.

Type-A γ-aminobutyric (GABAA) receptors are ligand-gated chloride channels with a very rich pharmacology. Some of their modulators, including benzodiazepines and general anaesthetics, are among the most successful drugs in clinical use and are common substances of abuse. Without reliable structural data, the mechanistic basis for the pharmacological modulation of GABAA receptors remains largely unknown. Here we report several high-resolution cryo-electron microscopy structures in which the full-length human α1β3γ2L GABAA receptor in lipid nanodiscs is bound to the channel-blocker picrotoxin, the competitive antagonist bicuculline, the agonist GABA (γ-aminobutyric acid), and the classical benzodiazepines alprazolam and diazepam. We describe the binding modes and mechanistic effects of these ligands, the closed and desensitized states of the GABAA receptor gating cycle, and the basis for allosteric coupling between the extracellular, agonist-binding region and the transmembrane, pore-forming region. This work provides a structural framework in which to integrate previous physiology and pharmacology research and a rational basis for the development of GABAA receptor modulators. Cryo-electron microscopy structures are reported in which the full-length human α1β3γ2L GABAA receptor in lipid nanodiscs is bound to the channel-blocker picrotoxin, the competitive antagonist bicuculline, the agonist GABA, and the benzodiazepines alprazolam and diazepam.

Gilean McVean and colleagues report the results of a large-scale clinical genome sequencing project spanning a broad spectrum of disorders. They identify factors influencing successful genetic diagnosis and highlight the challenges of interpreting findings for genetically heterogeneous disorders. To assess factors influencing the success of whole-genome sequencing for mainstream clinical diagnosis, we sequenced 217 individuals from 156 independent cases or families across a broad spectrum of disorders in whom previous screening had identified no pathogenic variants. We quantified the number of candidate variants identified using different strategies for variant calling, filtering, annotation and prioritization. We found that jointly calling variants across samples, filtering against both local and external databases, deploying multiple annotation tools and using familial transmission above biological plausibility contributed to accuracy. Overall, we identified disease-causing variants in 21% of cases, with the proportion increasing to 34% (23/68) for mendelian disorders and 57% (8/14) in family trios. We also discovered 32 potentially clinically actionable variants in 18 genes unrelated to the referral disorder, although only 4 were ultimately considered reportable. Our results demonstrate the value of genome sequencing for routine clinical diagnosis but also highlight many outstanding challenges.

One receptor binds two different types of proteoglycan at the same site but with divergent outcomes.

Glycoproteins present special problems for structural genomic analysis because they often require glycosylation in order to fold correctly, whereas their chemical and conformational heterogeneity generally inhibits crystallization. We show that the "glycosylation problem" can be solved by expressing glycoproteins transiently in mammalian cells in the presence of the N-glycosylation processing inhibitors, kifunensine or swainsonine. This allows the correct folding of the glycoproteins, but leaves them sensitive to enzymes, such as endoglycosidase H, that reduce the N-glycans to single residues, enhancing crystallization. Since the scalability of transient mammalian expression is now comparable to that of bacterial systems, this approach should relieve one of the major bottlenecks in structural genomic analysis.