Abstract L-Lactate, traditionally recognized as a waste product of metabolism, is now appreciated as a key intercellular energy currency in mammals. To enable investigations of intercellular shuttling of L-lactate, we have previously reported eLACCO1.1, a green fluorescent genetically encoded biosensor for extracellular L-lactate. eLACCO1.1 enables cellular resolution imaging of extracellular L-lactate in cultured mammalian cells and brain tissue. However, eLACCO1.1 spectrally overlaps with commonly used optical biosensors and actuators, limiting its application for multiplexed imaging or combined use with optogenetic actuators. Here, we report a red fluorescent extracellular L-lactate biosensor, designated R-eLACCO2. R-eLACCO2 is the end-product of extensive directed evolution and exhibits a large fluorescence response to L-lactate with high molecular specificity in vitro . We demonstrate that R-eLACCO2 with optimized leader and anchor sequences shows a large fluorescence change in response to extracellular L-lactate on the membrane of live mammalian cells. R-eLACCO2 should enable multicolor imaging of extracellular L-lactate in combination with other fluorescent probes and optogenetic actuators.

Abstract L-Lactate is a monocarboxylate produced during the process of cellular glycolysis and has long been generally considered a waste product. However, studies in recent decades have provided new perspectives on the physiological roles of L-lactate as a major energy substrate and a signaling molecule. To enable further investigations of the physiological roles of L-lactate, we have developed a series of high-performance (Δ F / F = 15 to 30 in vitro ), intensiometric, genetically-encoded green fluorescent protein (GFP)-based intracellular L-lactate biosensors with a range of affinities. We evaluated the performance of these biosensors by in vitro and live-cell characterization and demonstrated the utility with imaging applications in several cell lines.

Abstract l -Lactate is increasingly appreciated as a key metabolite and signaling molecule in mammals. To enable investigations of both the inter- and intra-cellular dynamics of l -Lactate, we develop a second-generation green fluorescent extracellular l -Lactate biosensor, designated eLACCO2.1, and a red fluorescent intracellular l -Lactate biosensor, designated R-iLACCO1. Compared to the first-generation eLACCO1.1 (Δ F / F = 1.5 in cultured neurons), eLACCO2.1 exhibits better membrane localization and fluorescence response (Δ F / F = 8.1 in cultured neurons) with faster response kinetics to extracellular l -Lactate on the surface of live mammalian cells. R-iLACCO1 and its affinity variants exhibit large fluorescence responses to changes in l -Lactate concentration in vitro (Δ F / F = 15 to 22) and in live mammalian cells (Δ F / F = 5.5 to 11). We demonstrate that these biosensors enable cellular-resolution imaging of extracellular and intracellular l -Lactate in cultured mammalian cells.

Abstract To enable investigations of the emerging roles of cell-to-cell shuttling of L-lactate, we have developed an intensiometric green fluorescent genetically encoded biosensor for extracellular L-lactate. We demonstrate that this biosensor, designated eLACCO1.1, enables minimally invasive cellular resolution imaging of extracellular L-lactate in cultured mammalian cells and brain tissue.

Abstract We combine a chemically-synthesized, voltage-sensitive fluorophore with a genetically encoded, self-labeling enzyme to enable voltage imaging in Drosophila melanogaster . Previously, we showed that a rhodamine voltage reporter (RhoVR) combined with the HaloTag self-labeling enzyme could be used to monitor membrane potential changes from mammalian neurons in culture and brain slice. Here, we apply this hybrid RhoVR-Halo approach in vivo to achieve selective neuron labeling in intact fly brains. We generate a Drosophila UAS-HaloTag reporter line in which the HaloTag enzyme is expressed on the surface of cells. We validate the voltage sensitivity of this new construct in cell culture before driving expression of HaloTag in specific brain neurons in flies. We show that selective labeling of synapses, cells, and brain regions can be achieved with RhoVR-Halo in either larval neuromuscular junction (NMJ) or in whole adult brains. Finally, we validate the voltage sensitivity of RhoVR-Halo in fly tissue via dual-electrode/imaging at the NMJ, show the efficacy of this approach for measuring synaptic excitatory post-synaptic potentials (EPSPs) in muscle cells, and perform voltage imaging of carbachol-evoked depolarization and osmolarity-evoked hyperpolarization in projection neurons and in interoceptive subesophageal zone neurons in fly brain explants following in vivo labeling. We envision the turn-on response to depolarizations, fast response kinetics, and two-photon compatibility of chemical indicators, coupled with the cellular and synaptic specificity of genetically-encoded enzymes, will make RhoVR-Halo a powerful complement to neurobiological imaging in Drosophila . Significance Statement Voltage imaging is a powerful method for interrogating neurobiology. Chemical indicators possess fast response kinetics, turn-on responses to membrane depolarization, and can be compatible with two-photon excitation. However, selective cell labeling in intact tissues and in vivo remains a challenge for completely synthetic fluorophores. Here, we show that a chemical – genetic hybrid approach in Drosophila enables cell-specific staining in vivo and voltage imaging in whole-brain explants and at neuromuscular junction synapses.

Abstract Synaptic Zn 2+ has emerged as a key neuromodulator in the brain. However, the lack of research tools for directly tracking synaptic Zn 2+ in the brain in live animals hinders our rigorous understanding of the physiological and pathological roles of synaptic Zn 2+ . In this study, we developed a genetically encoded far-red fluorescent indicator for monitoring synaptic Zn 2+ dynamics in the nervous system. Our engineered f ar-red fluorescent indicator for s ynaptic Z n 2+ (FRISZ) displayed a substantial Zn 2+ -specific turn-on response and low micromolar affinity. We genetically anchored FRISZ to the mammalian extracellular membrane via a transmembrane α-helix. We further successfully used membrane-tethered FRISZ (FRISZ-TM) to image synaptic Zn 2+ dynamics in response to sound in the primary auditory cortex (A1) in awake mice. This study thus establishes a new technology for studying the roles of synaptic Zn 2+ in the nervous system.

Abstract Two-photon microscopy together with fluorescent proteins and fluorescent protein-based biosensors are commonly used tools in neuroscience. To enhance their experimental scope, it is important to optimize fluorescent proteins for two-photon excitation. Directed evolution of fluorescent proteins under one-photon excitation is common, but many one-photon properties do not correlate with two-photon properties. A simple system for expressing fluorescent protein mutants is E. coli colonies on an agar plate. The small focal volume of two-photon excitation makes creating a high throughput screen in this system a challenge for a conventional point-scanning approach. We present an instrument and accompanying software that solves this challenge by selectively scanning each colony based on a colony map captured under one-photon excitation. This instrument, called the GIZMO, can measure the two-photon excited fluorescence of 10,000 E. coli colonies in 7 hours. We show that the GIZMO can be used to evolve a fluorescent protein under two-photon excitation.

Abstract In vivo imaging of model organisms is heavily reliant on fluorescent proteins with high intracellular brightness. Here we describe a practical method for rapid optimization of fluorescent proteins via directed molecular evolution in cultured mammalian cells. Using this method, we were able to perform screening of large gene libraries containing up to 2·10 7 independent random genes of fluorescent proteins expressed in HEK cells completing one iteration directed evolution in a course of ∼8 days. We employed this approach to develop a set of green and near-infrared fluorescent proteins with enhanced intracellular brightness. The developed near-infrared fluorescent proteins demonstrated high performance for fluorescent labeling of neurons in culture and in vivo in model organisms such as C.elegans , Drosophila , zebrafish, and mice. Spectral properties of the optimized near-infrared fluorescent proteins enabled crosstalk-free multicolor imaging in combination with common green and red fluorescent proteins, as well as dual-color near-infrared fluorescence imaging. The described method has a great potential to be adopted by protein engineers due to its simplicity and practicality. We also believe that the new enhanced fluorescent proteins will find wide application for in vivo multicolor imaging of small model organisms.

Serotonin (5-HT) is an important signaling monoamine in and beyond the central nervous system (CNS). We report structure-guided engineering of a green fluorescent, genetically encoded serotonin sensor (G-GESS) from a 5-HT-binding lipocalin in the soft tick. G-GESS shows fast response kinetics and high affinity, specificity, brightness, and photostability. We used G-GESS to image 5-HT dynamics in vitro and in behaving mice, demonstrating the broad utility of this novel biosensor.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Significance: Genetically encoded calcium ion (Ca2+) indicators (GECIs) are powerful tools for monitoring intracellular Ca2+ concentration changes in living cells and model organisms. In particular, GECIs have found particular utility for monitoring the transient increase of Ca2+ concentration that is associated with the neuronal action potential. However, the palette of highly optimized GECIs for imaging of neuronal activity remains relatively limited. Expanding the selection of available GECIs to include new colors and distinct photophysical properties could create new opportunities for in vitro and in vivo fluorescence imaging of neuronal activity. In particular, blue-shifted variants of GECIs are expected to have enhanced two-photon brightness, which would facilitate multiphoton microscopy. Aim: We describe the development and applications of T-GECO1 - a high-performance blue-shifted GECI based on the Clavularia sp.-derived mTFP1. Approach: We used protein engineering and extensive directed evolution to develop T-GECO1. We characterize the purified protein and assess its performance in vitro using one-photon excitation in cultured rat hippocampal neurons, in vivo using one-photon excitation fiber photometry in mice, and ex vivo using two-photon Ca2+ imaging in hippocampal slices. Results: The Ca2+-bound state of T-GECO1 has an excitation peak maximum of 468 nm, an emission peak maximum of 500 nm, an extinction coefficient of 49,300 M-1cm-1, a quantum yield of 0.83, and two-photon brightness approximately double that of EGFP. The Ca2+-dependent fluorescence increase is 15-fold and the apparent Kd for Ca2+ is 82 nM. With two-photon excitation conditions at 850 nm, T-GECO1 consistently enabled detection of action potentials with higher signal-to-noise (SNR) than a late generation GCaMP variant. Conclusion: T-GECO1 is a high performance blue-shifted GECI that, under two-photon excitation conditions, provides advantages relative to late generation GCaMP variants.