Abstract The molecular underpinnings that drive the heterogeneity of KRAS-mutant lung adenocarcinoma are poorly characterized. We performed an integrative analysis of genomic, transcriptomic, and proteomic data from early-stage and chemorefractory lung adenocarcinoma and identified three robust subsets of KRAS-mutant lung adenocarcinoma dominated, respectively, by co-occurring genetic events in STK11/LKB1 (the KL subgroup), TP53 (KP), and CDKN2A/B inactivation coupled with low expression of the NKX2-1 (TTF1) transcription factor (KC). We further revealed biologically and therapeutically relevant differences between the subgroups. KC tumors frequently exhibited mucinous histology and suppressed mTORC1 signaling. KL tumors had high rates of KEAP1 mutational inactivation and expressed lower levels of immune markers, including PD-L1. KP tumors demonstrated higher levels of somatic mutations, inflammatory markers, immune checkpoint effector molecules, and improved relapse-free survival. Differences in drug sensitivity patterns were also observed; notably, KL cells showed increased vulnerability to HSP90-inhibitor therapy. This work provides evidence that co-occurring genomic alterations identify subgroups of KRAS-mutant lung adenocarcinoma with distinct biology and therapeutic vulnerabilities. Significance: Co-occurring genetic alterations in STK11/LKB1, TP53, and CDKN2A/B—the latter coupled with low TTF1 expression—define three major subgroups of KRAS-mutant lung adenocarcinoma with distinct biology, patterns of immune-system engagement, and therapeutic vulnerabilities. Cancer Discov; 5(8); 860–77. ©2015 AACR. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 783

Ipilimumab improves clinical outcomes when combined with nivolumab in metastatic non-small cell lung cancer (NSCLC), but its efficacy and impact on the immune microenvironment in operable NSCLC remain unclear. We report the results of the phase 2 randomized NEOSTAR trial (NCT03158129) of neoadjuvant nivolumab or nivolumab + ipilimumab followed by surgery in 44 patients with operable NSCLC, using major pathologic response (MPR) as the primary endpoint. The MPR rate for each treatment arm was tested against historical controls of neoadjuvant chemotherapy. The nivolumab + ipilimumab arm met the prespecified primary endpoint threshold of 6 MPRs in 21 patients, achieving a 38% MPR rate (8/21). We observed a 22% MPR rate (5/23) in the nivolumab arm. In 37 patients resected on trial, nivolumab and nivolumab + ipilimumab produced MPR rates of 24% (5/21) and 50% (8/16), respectively. Compared with nivolumab, nivolumab + ipilimumab resulted in higher pathologic complete response rates (10% versus 38%), less viable tumor (median 50% versus 9%), and greater frequencies of effector, tissue-resident memory and effector memory T cells. Increased abundance of gut Ruminococcus and Akkermansia spp. was associated with MPR to dual therapy. Our data indicate that neoadjuvant nivolumab + ipilimumab-based therapy enhances pathologic responses, tumor immune infiltrates and immunologic memory, and merits further investigation in operable NSCLC. Neoadjuvant treatment with nivolumab plus ipilimumab is well tolerated and demonstrates clinical efficacy in patients with early stage lung cancer.

Abstract Mutant KRAS (KM) is the most common oncogene in lung cancer (LC). KM regulates several metabolic networks, but their role in tumorigenesis is still not sufficiently characterized to be exploited in cancer therapy. To identify metabolic networks specifically deregulated in KMLC, we characterized the lipidome of genetically engineered LC mice, cell lines, patient derived xenografts and primary human samples. We also determined that KMLC, but not EGFR-mutant (EGFR-MUT) LC, is enriched in triacylglycerides (TAG) and phosphatidylcholines (PC). We also found that KM upregulates fatty acid synthase (FASN), a rate-limiting enzyme in fatty acid (FA) synthesis promoting the synthesis of palmitate and PC. We determined that FASN is specifically required for the viability of KMLC, but not of LC harboring EGFR-MUT or wild type KRAS. Functional experiments revealed that FASN inhibition leads to ferroptosis, a reactive oxygen species (ROS)-and iron-dependent cell death. Consistently, lipidomic analysis demonstrated that FASN inhibition in KMLC leads to accumulation of PC with polyunsaturated FA (PUFA) chains, which are the substrate of ferroptosis. Integrating lipidomic, transcriptome and functional analyses, we demonstrated that FASN provides saturated (SFA) and monounsaturated FA (MUFA) that feed the Lands cycle, the main process remodeling oxidized phospholipids (PL), such as PC. Accordingly, either inhibition of FASN or suppression of the Lands cycle enzymes PLA2 and LPCAT3, promotes the intracellular accumulation of lipid peroxides and ferroptosis in KMLC both in vitro and in vivo . Our work supports a model whereby the high oxidative stress caused by KM dictates a dependency on newly synthesized FA to repair oxidated phospholipids, establishing a targetable vulnerability. These results connect KM oncogenic signaling, FASN induction and ferroptosis, indicating that FASN inhibitors already in clinical trial in KMLC patients ( NCT03808558 ) may be rapidly deployed as therapy for KMLC.

ABSTRACT Little is known of the geospatial architecture of individual cell populations in lung adenocarcinoma (LUAD) evolution. Here, we perform single-cell RNA sequencing of 186,916 cells from 5 early-stage LUADs and 14 multi-region normal lung tissues of defined spatial proximities from the tumors. We show that cellular lineages, states, and transcriptomic features geospatially evolve across normal regions to LUADs. LUADs also exhibit pronounced intratumor cell heterogeneity within single sites and transcriptional lineage-plasticity programs. T regulatory cell phenotypes are increased in normal tissues with proximity to LUAD, in contrast to diminished signatures and fractions of cytotoxic CD8+ T cells, antigen-presenting macrophages and inflammatory dendritic cells. We further find that the LUAD ligand-receptor interactome harbors increased expression of epithelial CD24 which mediates pro-tumor phenotypes. These data provide a spatial atlas of LUAD evolution, and a resource for identification of targets for its treatment. Statement of significance The geospatial ecosystem of the peripheral lung and early-stage LUAD is not known. Our multi-region single-cell sequencing analyses unravel cell populations, states, and phenotypes in the spatial and ecological evolution of LUAD from the lung that comprise high-potential targets for early interception.

Abstract Understanding cellular processes underlying early lung adenocarcinoma (LUAD) development is needed to devise intervention strategies 1 . Here, we studied 246,102 single epithelial cells from 16 early-stage LUADs and 47 matched normal lung samples. Epithelial cells comprised diverse normal alveolar and airway lineages as well as cancer cell populations. Diversity among cancer cells was strongly linked to LUAD patient-specific oncogenic drivers. KRAS -mutant cancer cells were unique in their transcriptional features, strikingly reduced differentiation, low levels of DNA copy number changes, and increased variability amongst the cells themselves. The local niche of LUADs, relative to that of normal lungs, was enriched with intermediary cells in lung alveolar differentiation with potential to transition to KRAS -mutant cancer cells. A subset of alveolar intermediate cells with elevated KRT8 expression ( KRT8 + alveolar cells; KACs) showed increased plasticity, and their gene expression profiles were enriched in lung precancer and LUAD and signified poor survival. Murine KACs were evident in lungs of tobacco carcinogen-exposed mice that develop KRAS -mutant LUADs but not in the saline-treated control group. While murine KACs emerged prior to tumor onset, they persisted for months after carcinogen cessation, acquired driver Kras mutations and, like their human counterparts, were poorly differentiated and harbored KRAS- specific transcriptional programs. This study provides new insights into early LUAD development and identifies potential targets for treatment.

Summary Determining the clinical significance of CT scan-detected subsolid pulmonary nodules requires an understanding of the molecular and cellular features that may foreshadow disease progression. We studied the alterations at the transcriptome level in both immune and non-immune cells, utilizing single-cell RNA sequencing, to compare the microenvironment of subsolid, solid, and non-involved lung tissues from surgical resection specimens. This evaluation of early spectrum lung adenocarcinoma reveals a significant decrease in the cytolytic activities of natural killer and natural killer T cells, accompanied by a reduction of effector T cells as well as an increase of CD4 + regulatory T cells in subsolid lesions. Characterization of non-immune cells revealed that both cancer-associated alveolar type 2 cells and fibroblasts contribute to the deregulation of the extracellular matrix, potentially affecting immune infiltration in subsolid lesions through ligand-receptor interactions. These findings suggest a decrement of immune surveillance in subsolid lesions.

Neuroblastoma is an embryonic tumor that represents the most common extracranial solid tumor in children. Resistance to therapy is attributed, in part, to the persistence of a subpopulation of slowly dividing cancer stem cells (CSCs) within those tumors. Glycogen synthase kinase (GSK)-3β is an active proline-directed serine/threonine kinase, well-known to be involved in different signaling pathways entangled in the pathophysiology of neuroblastoma. This study aims to assess the potency of an irreversible GSK-3β inhibitor drug, Tideglusib (TDG), in suppressing proliferation, viability, and migration of human neuroblastoma cell lines, as well as its effects on their CSCs subpopulation in vitro and in vivo. Our results showed that treatment with TDG significantly reduced cell proliferation, viability, and migration of SK-N-SH and SH-SY5Y cells. TDG also significantly inhibited neurospheres formation capability in both cell lines, eradicating the self-renewal ability of highly resistant CSCs. Importantly, TDG potently inhibited neuroblastoma tumor growth and progression in vivo. In conclusion, TDG proved to be an effective in vitro and in vivo treatment for neuroblastoma cell lines and may hence serve as a potential adjuvant therapeutic agent for this aggressive nervous system tumor.

The novel coronavirus SARS-CoV-2 was identified as the causative agent of the ongoing pandemic COVID 19. COVID-19-associated deaths are mainly attributed to severe pneumonia and respiratory failure. Recent work demonstrated that SARS-CoV-2 binds to angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in the lung. To better understand ACE2 abundance and expression patterns in the lung we interrogated our in-house single-cell RNA-sequencing dataset containing 70,085 EPCAM+ lung epithelial cells from paired normal and lung adenocarcinoma tissues. Transcriptomic analysis revealed a diverse repertoire of airway lineages that included alveolar type I and II, bronchioalveolar, club/secretory, quiescent and proliferating basal, ciliated and malignant cells as well as rare populations such as ionocytes. While the fraction of lung epithelial cells expressing ACE2 was low (1.7% overall), alveolar type II (AT2, 2.2% ACE2 +) cells exhibited highest levels of ACE2 expression among all cell subsets. Further analysis of the AT2 compartment (n = 27,235 cells) revealed a number of genes co-expressed with ACE2 that are important for lung pathobiology including those associated with chronic obstructive pulmonary disease (COPD; HHIP ), pneumonia and infection ( FGG and C4BPA ) as well as malarial/bacterial ( CD36 ) and viral ( DMBT1 ) scavenging which, for the most part, were increased in smoker versus light or non-smoker cells. Notably, DMBT1 was highly expressed in AT2 cells relative to other lung epithelial subsets and its expression positively correlated with ACE2 . We describe a population of ACE2 -positive AT2 cells that co-express pathogen (including viral) receptors (e.g. DMBT1 ) with crucial roles in host defense thus comprising plausible phenotypic targets for treatment of COVID-19.### Competing Interest StatementAES is an employee of Johnson and Johnson and has shares in Veracyte. HK receives funding to MD Anderson Cancer Center from Johnson and Johnson. TC has received speaker’s fees from the Society for Immunotherapy of Cancer and Bristol-Myers Squibb; receives consulting/advisory role fees from MedImmune, Bristol-Myers Squibb and EMD Serono, and research funding to MD Anderson Cancer Center from Boehringer Ingelheim, MedImmune and Bristol-Myers Squibb outside the scope of this work. All other authors declare no competing interests.