Characterizing the interactions that SARS-CoV-2 viral RNAs make with host cell proteins during infection can improve our understanding of viral RNA functions and the host innate immune response. Using RNA antisense purification and mass spectrometry, we identified up to 104 human proteins that directly and specifically bind to SARS-CoV-2 RNAs in infected human cells. We integrated the SARS-CoV-2 RNA interactome with changes in proteome abundance induced by viral infection and linked interactome proteins to cellular pathways relevant to SARS-CoV-2 infections. We demonstrated by genetic perturbation that cellular nucleic acid-binding protein (CNBP) and La-related protein 1 (LARP1), two of the most strongly enriched viral RNA binders, restrict SARS-CoV-2 replication in infected cells and provide a global map of their direct RNA contact sites. Pharmacological inhibition of three other RNA interactome members, PPIA, ATP1A1, and the ARP2/3 complex, reduced viral replication in two human cell lines. The identification of host dependency factors and defence strategies as presented in this work will improve the design of targeted therapeutics against SARS-CoV-2.

ABSTRACT SARS-CoV-2 infections pose a global threat to human health and an unprecedented research challenge. Among the most urgent tasks is obtaining a detailed understanding of the molecular interactions that facilitate viral replication or contribute to host defense mechanisms in infected cells. While SARS-CoV-2 co-opts cellular factors for viral translation and genome replication, a comprehensive map of the host cell proteome in direct contact with viral RNA has not been elucidated. Here, we use RNA antisense purification and mass spectrometry (RAP-MS) to obtain an unbiased and quantitative picture of the human proteome that directly binds the SARS-CoV-2 RNA in infected human cells. We discover known host factors required for coronavirus replication, regulators of RNA metabolism and host defense pathways, along with dozens of potential drug targets among direct SARS-CoV-2 binders. We further integrate the SARS-CoV-2 RNA interactome with proteome dynamics induced by viral infection, linking interactome proteins to the emerging biology of SARS-CoV-2 infections. Validating RAP-MS, we show that CNBP, a regulator of proinflammatory cytokines, directly engages the SARS-CoV-2 RNA. Supporting the functional relevance of identified interactors, we show that the interferon-induced protein RYDEN suppresses SARS-CoV-2 ribosomal frameshifting and demonstrate that inhibition of SARS-CoV-2-bound proteins is sufficient to manipulate viral replication. The SARS-CoV-2 RNA interactome provides an unprecedented molecular perspective on SARS-CoV-2 infections and enables the systematic dissection of host dependency factors and host defense strategies, a crucial prerequisite for designing novel therapeutic strategies.

Abstract Although a potent Yellow fever vaccine is available since 1937, up to 200.000 severe cases are reported per year, which indicates that virus vaccines require additional support by antiviral therapies. Direct-acting antiviral drugs against severe and widespread diseases, such as DENV and Yellow fever infections with more than millions of diagnosed diseases per year, are still not available. Since antivirals’ development against neglected diseases is uneconomical, a broadspectrum antiviral compound would be of public benefit. Here, we show that IMP-1088, a recently published myristoyltransferase-1/2 inhibitor suppressing Rhino- and Polioviruses, inhibits replication of HIV-1, Yellow fever virus, Dengue virus, Vaccinia virus, CMV, and human Herpesvirus 8 in the low nanomolar range, indicating that IMP-1088 has broad-range activity against different pathogenic virus families. The inhibition relies on virally encoded myristoylation signals since Zika, Chikungunya, and Enterovirus 71 are not affected by IMP-1088. Furthermore, we show that the Yellow fever NS5 protein is myristoylated and IMP-1088 treatment of Dengue and Yellow fever infected cells leads to a re-localisation of the viral NS5 proteins. Author Summary Treatment of viral diseases requires the development of tailored drugs specific to inhibit certain virus families. This specificity results in missing treatment options for important human pathogens such as Yellow fever and Dengue virus infection since the development is laborious and costly. Substances acting on various virus families could solve this problem. Here, we describe that IMP-1088, an inhibitor of the cellular myristoyltransferase, inhibits HIV-1, Dengue virus, Yellow fever viruses, Vaccinia virus, and Herpesviruses at low concentrations, which do not affect cell proliferation. Viruses without predicated myristoylation sites, such as Zika viruses, were not inhibited by IMP-1088. Since no experimental evidence was provided that Yellow fever virus proteins are myristoylated, we analysed the post-translational modification of Yellow fever NS5 protein. We determined the subcellular localisation to understand the mechanism of the IMP-1088 mediated suppression and could show that both the Dengue and the Yellow fever NS5 proteins are re-localised by IMP-1088 treatment.

Abstract To circumvent time-consuming clinical trials, testing whether existing drugs are effective inhibitors of SARS-CoV-2, has led to the discovery of Remdesivir. We decided to follow this path and screened approved medications “off-label” against SARS-CoV-2. In these screenings, Fluoxetine inhibited SARS-CoV-2 at a concentration of 0.8µg/ml significantly, and the EC50 was determined with 387ng/ml. Fluoxetine is a racemate consisting of both stereoisomers, while the S-form is the dominant serotonin reuptake inhibitor. We found that both isomers show similar activity on the virus. Fluoxetine treatment resulted in a decrease in viral protein expression. Furthermore, Fluoxetine inhibited neither Rabies virus, human respiratory syncytial virus replication nor the Human Herpesvirus 8 or Herpes simplex virus type 1 gene expression, indicating that it acts virus-specific. We see the role of Fluoxetine in the early treatment of SARS-CoV-2 infected patients of risk groups.

Abstract Aspirin, with its active compound acetylsalicylic acid (ASA), shows antiviral activity against rhino- and influenza viruses and at high concentrations. We sought to investigate whether ASA and its metabolite salicylic acid (SA) inhibit SARS-CoV-2 since it might use similar pathways to influenza viruses. The compound-treated cells were infected with SARS-CoV-2. Viral replication was analyzed by RTqPCR. The compounds suppressed SARS-CoV-2 replication in cell culture cells and in a patient-near replication system using human precision-cut lung slices by two orders of magnitude. The compounds did not interfere with viral entry but led to lower viral RNA expression after 24 h.

Abstract Cellular metabolism must adapt rapidly to environmental alterations and adjust nutrient uptake. Low glucose availability activates the AMP-dependent kinase (AMPK) pathway. We demonstrate that activation of AMPK or the downstream Unc-51-like autophagy-activating kinase (ULK1) inhibits receptor-mediated endocytosis. Beyond limiting dextran-uptake, this activation prevents endocytic uptake of human pathogenic enveloped and non-enveloped, positive and negative-stranded RNA viruses, such as yellow fever, dengue, tick-borne encephalitis, chikungunya, polio, rubella, rabies lyssavirus and SARS-CoV-2 not only in mammalian and insect cells but in precision-cut lung slices and neuronal organoids. However, receptor presentation at the cytoplasmic membrane was unaffected, indicating that receptor-binding remained unaltered and later steps of endocytosis were targeted. Indeed, AMPK pathway activation reduced early endocytic factors TXNIP, Rab5 and the late endosomal marker Rab7 amounts. Furthermore, AMPK activation impaired SARS-CoV-2 late-replication steps by reducing viral RNAs and proteins and the endo-lysosomal markers LAMP1 and GRP78, suggesting a reduction of early and late endosomes and lysosomes. Inhibition of the PI3K and mTORC2 pathways, which sense amino acids and growth factor availability, promotes AMPK activity and blocks viral entry. Our results indicate that AMPK and ULK1 emerge as restriction factors of cellular endocytosis, impeding the receptor-mediated endocytic entry of enveloped and non-enveloped RNA viruses.