Nanobodies that neutralize Monoclonal antibodies that bind to the spike protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) show therapeutic promise but must be produced in mammalian cells and need to be delivered intravenously. By contrast, single-domain antibodies called nanobodies can be produced in bacteria or yeast, and their stability may enable aerosol delivery. Two papers now report nanobodies that bind tightly to spike and efficiently neutralize SARS-CoV-2 in cells. Schoof et al. screened a yeast surface display of synthetic nanobodies and Xiang et al. screened anti-spike nanobodies produced by a llama. Both groups identified highly potent nanobodies that lock the spike protein in an inactive conformation. Multivalent constructs of selected nanobodies achieved even more potent neutralization. Science , this issue p. 1473 , p. 1479

Without an effective prophylactic solution, infections from SARS-CoV-2 continue to rise worldwide with devastating health and economic costs. SARS-CoV-2 gains entry into host cells via an interaction between its Spike protein and the host cell receptor angiotensin converting enzyme 2 (ACE2). Disruption of this interaction confers potent neutralization of viral entry, providing an avenue for vaccine design and for therapeutic antibodies. Here, we develop single-domain antibodies (nanobodies) that potently disrupt the interaction between the SARS-CoV-2 Spike and ACE2. By screening a yeast surface-displayed library of synthetic nanobody sequences, we identified a panel of nanobodies that bind to multiple epitopes on Spike and block ACE2 interaction via two distinct mechanisms. Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) revealed that one exceptionally stable nanobody, Nb6, binds Spike in a fully inactive conformation with its receptor binding domains (RBDs) locked into their inaccessible down-state, incapable of binding ACE2. Affinity maturation and structure-guided design of multivalency yielded a trivalent nanobody, mNb6-tri, with femtomolar affinity for SARS-CoV-2 Spike and picomolar neutralization of SARS-CoV-2 infection. mNb6-tri retains stability and function after aerosolization, lyophilization, and heat treatment. These properties may enable aerosol-mediated delivery of this potent neutralizer directly to the airway epithelia, promising to yield a widely deployable, patient-friendly prophylactic and/or early infection therapeutic agent to stem the worst pandemic in a century.

Abstract Hsp90 is a ubiquitous molecular chaperone that facilitates the folding and maturation of hundreds of cellular “client” proteins. The ATP-driven client maturation process is regulated by a large number of co-chaperones. Among them, Aha1 is the most potent activator of Hsp90 ATPase activity and thus dramatically affects Hsp90’s client proteins. To understand the Aha1 activation mechanism, we determined full-length Hsp90:Aha1 structures in six different states by cryo-electron microscopy, including nucleotide-free semi-closed, nucleotide-bound pre-hydrolysis, and semi-hydrolyzed states. Our structures demonstrate that the two Aha1 domains can each interact with Hsp90 in two different modes, uncovering a complex multistep activation mechanism. The results show that Aha1 accelerates the chemical step of ATP hydrolysis like a conventional enzyme, but most unusually, catalyzes the rate-limiting large-scale conformational changes of Hsp90 fundamentally required for ATP hydrolysis. Our work provides a structural framework to guide small molecule development targeting this critical modulator of client protein maturation.

Abstract TRAP1 is a mitochondrion specific Hsp90, a ubiquitous chaperone family that mediates the folding and maturation of hundreds of “client” proteins. Through the interaction with client proteins, TRAP1 regulates mitochondrial protein homeostasis, oxidative phosphorylation/glycolysis balance, and plays a critical role in mitochondrial dynamics and disease. However, the molecular mechanism of client protein recognition and remodeling by TRAP1 remains elusive. Here we established the succinate dehydrogenase B subunit (SdhB) from mitochondrial complex II as a client protein for TRAP1 amenable to detailed biochemical and structural investigation. SdhB accelerates the rate of TRAP1 dimer closure and ATP hydrolysis by 5-fold. Cryo-EM structures of the TRAP1:SdhB complex show TRAP1 stabilizes SdhB folding intermediates by trapping an SdhB segment in the TRAP1 lumen. Unexpectedly, client protein binding induces an asymmetric to symmetric transition in the TRAP1 closed state. Our results highlight a client binding mechanism conserved throughout Hsp90s that transcends the need for cochaperones and provide molecular insights into how TRAP1 modulates protein folding within mitochondria. Our structures also suggest a potential role for TRAP1 in Fe-S cluster biogenesis and mitochondrial protein import and will guide small molecule development for therapeutic intervention in specific TRAP1 client interactions.

Abstract Hsp90 is a ubiquitous molecular chaperone that mediates the folding and maturation of hundreds of “client” proteins. Although Hsp90s generally function as homodimers, recent discoveries suggested that the mitochondrion specific Hsp90 (TRAP1) also forms functionally relevant tetramers. The structural mechanism of tetramer formation remains elusive. Here we used a combination of solution, biochemical and cryo-electron microscopy (cryo-EM) approaches to confirm that, independent of nucleotide state, a subpopulation of TRAP1 exists as tetramers. Unexpectedly, cryo-EM reveals multiple tetramer conformations having TRAP1 dimers arranged in orthogonal, parallel, or antiparallel configurations. The cryo-EM structure of one of the orthogonal tetrameric states was determined at 3.5 Å resolution. Each of the two TRAP1 dimers is in a symmetric AMP·PNP-bound closed state with the tetramer being stabilized through three distinct dimer-dimer interaction sites. In unique ways, each of the three TRAP1 domains contributes to tetramer formation. In addition to tetramerization via direct dimer-dimer contacts, our structure suggests that additional stabilization could come from domain swapping between the dimers. These results expand our understanding of TRAP1 biology beyond the conventional view of a functional dimer and provide a platform to further explore the function and regulation of tetrameric TRAP1 in mitochondria.