Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR) RNA-guided nucleases (RGNs) are highly efficient genome editing tools. CRISPR-associated 9 (Cas9) RGNs are directed to genomic loci by guide RNAs (gRNAs) containing 20 nucleotides that are complementary to a target DNA sequence. However, RGNs can induce mutations at sites that differ by as many as five nucleotides from the intended target. Here we report that truncated gRNAs, with shorter regions of target complementarity <20 nucleotides in length, can decrease undesired mutagenesis at some off-target sites by 5,000-fold or more without sacrificing on-target genome editing efficiencies. In addition, use of truncated gRNAs can further reduce off-target effects induced by pairs of Cas9 variants that nick DNA (paired nickases). Our results delineate a simple, effective strategy to improve the specificities of Cas9 nucleases or paired nickases.

Although CRISPR-Cas9 nucleases are widely used for genome editing, the range of sequences that Cas9 can recognize is constrained by the need for a specific protospacer adjacent motif (PAM). As a result, it can often be difficult to target double-stranded breaks (DSBs) with the precision that is necessary for various genome-editing applications. The ability to engineer Cas9 derivatives with purposefully altered PAM specificities would address this limitation. Here we show that the commonly used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) can be modified to recognize alternative PAM sequences using structural information, bacterial selection-based directed evolution, and combinatorial design. These altered PAM specificity variants enable robust editing of endogenous gene sites in zebrafish and human cells not currently targetable by wild-type SpCas9, and their genome-wide specificities are comparable to wild-type SpCas9 as judged by GUIDE-seq analysis. In addition, we identify and characterize another SpCas9 variant that exhibits improved specificity in human cells, possessing better discrimination against off-target sites with non-canonical NAG and NGA PAMs and/or mismatched spacers. We also find that two smaller-size Cas9 orthologues, Streptococcus thermophilus Cas9 (St1Cas9) and Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9), function efficiently in the bacterial selection systems and in human cells, suggesting that our engineering strategies could be extended to Cas9s from other species. Our findings provide broadly useful SpCas9 variants and, more importantly, establish the feasibility of engineering a wide range of Cas9s with altered and improved PAM specificities.

Efficient protein delivery using cationic lipid transfection reagents enables high efficiency protein-based genome editing in vivo and in vitro. Efficient intracellular delivery of proteins is needed to fully realize the potential of protein therapeutics. Current methods of protein delivery commonly suffer from low tolerance for serum, poor endosomal escape and limited in vivo efficacy. Here we report that common cationic lipid nucleic acid transfection reagents can potently deliver proteins that are fused to negatively supercharged proteins, that contain natural anionic domains or that natively bind to anionic nucleic acids. This approach mediates the potent delivery of nM concentrations of Cre recombinase, TALE- and Cas9-based transcription activators, and Cas9:sgRNA nuclease complexes into cultured human cells in media containing 10% serum. Delivery of unmodified Cas9:sgRNA complexes resulted in up to 80% genome modification with substantially higher specificity compared to DNA transfection. This approach also mediated efficient delivery of Cre recombinase and Cas9:sgRNA complexes into the mouse inner ear in vivo, achieving 90% Cre-mediated recombination and 20% Cas9-mediated genome modification in hair cells.

Short guide RNAs (gRNAs) can direct catalytically inactive CRISPR-associated 9 nuclease (dCas9) to repress endogenous genes in bacteria and human cells. Here we show that single or multiple gRNAs can direct dCas9 fused to a VP64 transcriptional activation domain to increase expression of endogenous human genes. This proof-of-principle work shows that clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-Cas systems can target heterologous effector domains to endogenous sites in human cells.

Transcription activator–like effector nucleases (TALENs) enable genetic modification at specific sites in a genome. Reyon et al. present a method for high-throughput generation of TALENs, facilitating large-scale genome engineering. Engineered transcription activator–like effector nucleases (TALENs) have shown promise as facile and broadly applicable genome editing tools. However, no publicly available high-throughput method for constructing TALENs has been published, and large-scale assessments of the success rate and targeting range of the technology remain lacking. Here we describe the fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) system, a rapid and cost-effective method for large-scale assembly of TALENs. We tested 48 FLASH-assembled TALEN pairs in a human cell–based EGFP reporter system and found that all 48 possessed efficient gene-modification activities. We also used FLASH to assemble TALENs for 96 endogenous human genes implicated in cancer and/or epigenetic regulation and found that 84 pairs were able to efficiently introduce targeted alterations. Our results establish the robustness of TALEN technology and demonstrate that FLASH facilitates high-throughput genome editing at a scale not currently possible with other genome modification technologies.

To achieve its precise neural connectivity, the developing mammalian nervous system undergoes extensive activity-dependent synapse remodelling. Recently, microglial cells have been shown to be responsible for a portion of synaptic pruning, but the remaining mechanisms remain unknown. Here we report a new role for astrocytes in actively engulfing central nervous system synapses. This process helps to mediate synapse elimination, requires the MEGF10 and MERTK phagocytic pathways, and is strongly dependent on neuronal activity. Developing mice deficient in both astrocyte pathways fail to refine their retinogeniculate connections normally and retain excess functional synapses. Finally, we show that in the adult mouse brain, astrocytes continuously engulf both excitatory and inhibitory synapses. These studies reveal a novel role for astrocytes in mediating synapse elimination in the developing and adult brain, identify MEGF10 and MERTK as critical proteins in the synapse remodelling underlying neural circuit refinement, and have important implications for understanding learning and memory as well as neurological disease processes. This study describes comprehensive synaptic engulfment by astrocytes, mediating synapse elimination in an activity-dependent manner; this elimination process involves the MEGF10 and MERTK phagocytic pathways and persists into adulthood, with mutant mice that lack these pathways in astrocytes exhibiting a failure to refine retinogeniculate connections during development. Synapse elimination is an important aspect of brain development in which the number of synaptic contacts is reduced in an activity-dependent manner. Glial cells — non-neural cells that perform a variety of roles in the brain — were recently shown to have a role in synapse remodelling, with the phagocytic microglia responsible for a certain proportion of connection refinement, with little else known regarding the mechanisms underlying this. Here, Won-Suk Chung et al. describe comprehensive synaptic engulfment by astrocytes, mediating synapse elimination in an activity-dependent manner. This elimination process involved the MEGF10 and MERTK phagocytic pathways, with transgenic animals lacking these pathways in astrocytes exhibiting a failure to refine retinogeniculate connections during development. These mechanisms also extend into adulthood. This work has implications for our understanding of learning and memory as well as neurological disease processes.