The host response to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection can result in prolonged pathologies collectively referred to as post-acute sequalae of COVID-19 (PASC) or long COVID. To better understand the mechanism underlying long COVID biology, we compared the short- and long-term systemic responses in the golden hamster after either SARS-CoV-2 or influenza A virus (IAV) infection. Results demonstrated that SARS-CoV-2 exceeded IAV in its capacity to cause permanent injury to the lung and kidney and uniquely affected the olfactory bulb (OB) and olfactory epithelium (OE). Despite a lack of detectable infectious virus, the OB and OE demonstrated myeloid and T cell activation, proinflammatory cytokine production, and an interferon response that correlated with behavioral changes extending a month after viral clearance. These sustained transcriptional changes could also be corroborated from tissue isolated from individuals who recovered from COVID-19. These data highlight a molecular mechanism for persistent COVID-19 symptomology and provide a small animal model to explore future therapeutics.

SUMMARY SARS-CoV-2 has been found capable of inducing prolonged pathologies collectively referred to as Long-COVID. To better understand this biology, we compared the short- and long-term systemic responses in the golden hamster following either SARS-CoV-2 or influenza A virus (IAV) infection. While SARS-CoV-2 exceeded IAV in its capacity to cause injury to the lung and kidney, the most significant changes were observed in the olfactory bulb (OB) and olfactory epithelium (OE) where inflammation was visible beyond one month post SARS-CoV-2 infection. Despite a lack of detectable virus, OB/OE demonstrated microglial and T cell activation, proinflammatory cytokine production, and interferon responses that correlated with behavioral changes. These findings could be corroborated through sequencing of individuals who recovered from COVID-19, as sustained inflammation in OB/OE tissue remained evident months beyond disease resolution. These data highlight a molecular mechanism for persistent COVID-19 symptomology and characterize a small animal model to develop future therapeutics.

Despite being largely confined to the airways, SARS-CoV-2 infection has been associated with sensory abnormalities that manifest in both acute and long-lasting phenotypes. To gain insight on the molecular basis of these sensory abnormalities, we used the golden hamster infection model to characterize the effects of SARS-CoV-2 versus Influenza A virus (IAV) infection on the sensory nervous system. Efforts to detect the presence of virus in the cervical/thoracic spinal cord and dorsal root ganglia (DRGs) demonstrated detectable levels of SARS-CoV-2 by quantitative PCR and RNAscope uniquely within the first 24 hours of infection. SARS-CoV-2-infected hamsters demonstrated mechanical hypersensitivity during acute infection; intriguingly, this hypersensitivity was milder, but prolonged when compared to IAV-infected hamsters. RNA sequencing (RNA-seq) of thoracic DRGs from acute infection revealed predominantly neuron-biased signaling perturbations in SARS-CoV-2-infected animals as opposed to type I interferon signaling in tissue derived from IAV-infected animals. RNA-seq of 31dpi thoracic DRGs from SARS-CoV-2-infected animals highlighted a uniquely neuropathic transcriptomic landscape, which was consistent with substantial SARS-CoV-2-specific mechanical hypersensitivity at 28dpi. Ontology analysis of 1, 4, and 30dpi RNA-seq revealed novel targets for pain management, such as ILF3. Meta-analysis of all SARS-CoV-2 RNA-seq timepoints against preclinical pain model datasets highlighted both conserved and unique pro-nociceptive gene expression changes following infection. Overall, this work elucidates novel transcriptomic signatures triggered by SARS-CoV-2 that may underlie both short- and long-term sensory abnormalities while also highlighting several therapeutic targets for alleviation of infection-induced hypersensitivity.

SARS-CoV-2, the virus responsible for the COVID-19 pandemic, has been found capable of inducing long term effects commonly referred to as post-acute sequelae of SARS-CoV-2 (PASC) or long COVID. To define the molecular basis of this condition, we compared the short- and long-term responses to influenza A virus and SARSCoV-2 in the golden hamster model. These data demonstrated that SARS-CoV-2 resulted in sustained changes to lung, kidney, and brain. The most significant change in response to SARS-CoV-2 was observed in the olfactory bulb, where persistent inflammation was visible beyond one month post infection. This was characterized by microglial activation, pro-inflammatory cytokine production, and a Type I interferon (IFN-I) response in the absence of detectable virus. Given the connection between olfactory bulb injury and neurological disorders, we postulate that this prolonged inflammation is an underlying cause of long COVID.Funding Information: This work was funded by generous support from the Marc Haas Foundation, the National Institutes of Health (NCI (R01CA234614) and NIAID (2R01AI107301) and NIDDK (R01DK121072 and 1RO3DK117252) to Department of Medicine, Weill Cornell Medicine (R.E.S.)), and DARPA's PREPARE Program (HR0011-20-2-0040). The work was further funded by NINDS (NS111251, NSO86444, NSO86444S1)(V.Z., R.A.S.).Ethics Approval Statement: The Tissue Procurement Facility operates under Institutional Review Board (IRB) approved protocol and follows guidelines set by Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA). Experiments using samples from human subjects were conducted in accordance with local regulations and with the approval of the IRB at the Weill Cornell Medicine. The autopsy samples are considered human tissue research and were collected under IRB protocols 20-04021814 and 19-11021069. All autopsies have consent for research use from next of kin, and these studies were determined as exempt by IRB at Weill Cornell Medicine under those protocol numbers.

Abstract ID 20519 Poster Board 80 Histone deacetylase 6 (HDAC6) is a Class IIb histone deacetylase, which is primarily located in the cytoplasm and plays an important role in cell cycle progression and transcriptional regulation. Earlier studies from our group and others have shown that HDAC6 inhibitors alleviate sensory signs of chemotherapy-induced and nerve injury-induced peripheral neuropathy. Furthermore, our recent data show that downregulation of HDAC6 in the dorsal root ganglia (DRG), achieved by injection of the sciatic nerve of adult male HDAC6^fl\fl mice with AAV8-Cre-EGFP vectors, results in recovery from mechanical allodynia in paclitaxel chemotherapy induced peripheral neuropathy (CIPN) model. We demonstrate that DRG-knockdown of HDAC6 prevents the development of mechanical allodynia after the paclitaxel CIPN model. We also use the murine spared nerve injury (SNI) model of neuropathic pain to determine the impact of the peripherally acting HDAC6 inhibitor ACY1215 (Regenacy Pharmaceutics) on the alleviation of sensory hypersensitivity behaviors. Using the von Frey assay, we demonstrate that treatment with ACY1215 (30mg/kg) leads to recovery from mechanical allodynia developed after SNI injury in both male and female mice without affecting locomotor activity. We performed bulk tissue RNA Sequencing analysis to understand transcriptomic events and pathways in the DRG associated with the antiallodynic actions of ACY1215. We found over 800 differentially expressed genes (DEG) in the SNI condition between vehicle and ACY1215-treated animals. Most of the pathways affected by these DEGs are associated with inflammatory disorders and B-cell mechanisms, suggesting a potential impairment of circulating immune cell infiltration in to the DRG after injury, which has been shown to be necessary for the induction of sensory hypersensitivity. Furthermore, a separate bulk RNA-seq analysis of L3-6 DRGs 7 weeks after SNI highlighted a significant upregulation of several alpha- and beta-tubulin transcripts. Prior work by others suggests that this may be a compensatory response to nerve injury-induced tubulin destabilization. Therefore, we hypothesize that HDAC6 inhibition may address this molecular maladaptation by increasing acetylated tubulin levels and promoting stability and we are using Western Blot analysis to assess alpha- and beta- tubulin acetylating in the DRG following peripheral nerve injury with and without treatment with HDAC6 inhibitors. An alternative hypothesis is that HDAC6 acts as a transcription factor, and it targets several genes that are associated with hereditary neurodegenerative diseases. We hypothesize that several of these genes are regulated under SNI conditions that are rescued under the presence of ACY1215. We are testing this hypothesis by use of qPCR and Western Blot analysis. Our findings highlight a promising therapeutic role of HDAC6 inhibitors for the alleviation of sensory hypersensitivity behaviors associated with peripheral nerve injury. Future work will define the mechanisms underlying HDAC6 action in the DRG and will test if interventions in HDAC6 activity in subjects suffering from prolonged peripheral nerve injury may reverse sensory and affective manifestations of neuropathic pain. Support/Funding Information: RO1 NS086444 NINDS.

Abstract ID 100904 Poster Board 531 Histone deacetylase 6 (HDAC6) is a Class IIb histone deacetylase that plays an important role in cell cycle progression, cytoskeletal dynamics, and transcriptional regulation. Earlier studies from our group and others have shown that HDAC6 inhibitors alleviate sensory signs of chemotherapy-induced and nerve-injury-induced peripheral neuropathy. Furthermore, our recent data show that one possible mechanism of action of HDAC6 alleviating sensory signs of neuropathy is through the diminished recruitment of immune cells in the dorsal root ganglia (DRG). In this study, we used multiple pain models, including the spared nerve injury (SNI) model, paclitaxel chemotherapy induced peripheral neuropathy model (CIPN), Complete Freund's Adjuvant (CFA) model, and the paw incision model to demonstrate that inhibition of enzymatic activity of HDAC6 in the peripheral nervous system prevents the development of mechanical allodynia. We used the SNI and paw-incision model to evaluate the actions of a peripherally acting HDAC6 inhibitor, ACY1215, in sensory hypersensitivity behaviors. Using the von Frey assay, we demonstrate that treatment with ACY1215 (30mg/kg) leads to recovery from mechanical allodynia developed after SNI injury in male mice without affecting locomotor activity. We performed whole tissue RNA Sequencing analysis to identify differentially expressed genes in the mouse DRG following three weeks of treatment with ACY1215 or vehicle. With over 800 differentially expressed genes (log₂FC ³ |0.32| and p-nominal < 0.05) between ACY1215 and vehicle in the SNI condition, Ingenuity Pathway Analysis (IPA) predicted most of the top canonical pathways affected were associated with inflammatory signaling, including Neutrophil Extracellular Trap Signaling Pathway and Macrophage Alternative Activation Signaling Pathway. Additionally, we also utilized adult male HDAC6^flfl mice to conditionally downregulate HDAC6 in the DRG by injecting the sciatic nerve with AAV8-Cre-EGFP or AAV8-EGFP vectors, across multiple pain models including the paclitaxel CIPN model, SNI model, and CFA model. We demonstrated that across all three models, the downregulation of HDAC6 resulted in recovery from mechanical sensitivity using the von Frey assay. We next used qPCR analysis to gain more information on the macrophage and neutrophil infiltrating cell populations in the DRG of mice exposed to different pain models, and found that Ccr5, Cd209f, Cx3cr1, Mpo, S100a9, and Ccl5 decreased across several pain models after reduced HDAC6 enzymatic activity or expression. Our findings highlight a promising therapeutic role of HDAC6 inhibitors for the alleviation of sensory hypersensitivity behaviors associated with peripheral nerve injury, as well as a novel DRG mechanism underlying these effects. Future work will continue exploring HDAC6 action in the DRG and will assess the role of circulating cytokines in models of chronic pain.