The fit of atomic models of protein structures to high-resolution cryo-electron microscopy maps can be assessed with a validation tool, EMRinger. Advances in high-resolution cryo-electron microscopy (cryo-EM) require the development of validation metrics to independently assess map quality and model geometry. We report EMRinger, a tool that assesses the precise fitting of an atomic model into the map during refinement and shows how radiation damage alters scattering from negatively charged amino acids. EMRinger ( https://github.com/fraser-lab/EMRinger ) will be useful for monitoring progress in resolving and modeling high-resolution features in cryo-EM.

Cryo-EM has revealed the structures of many challenging yet exciting macromolecular assemblies at near-atomic resolution (3–4.5Å), providing biological phenomena with molecular descriptions. However, at these resolutions, accurately positioning individual atoms remains challenging and error-prone. Manually refining thousands of amino acids – typical in a macromolecular assembly – is tedious and time-consuming. We present an automated method that can improve the atomic details in models that are manually built in near-atomic-resolution cryo-EM maps. Applying the method to three systems recently solved by cryo-EM, we are able to improve model geometry while maintaining the fit-to-density. Backbone placement errors are automatically detected and corrected, and the refinement shows a large radius of convergence. The results demonstrate that the method is amenable to structures with symmetry, of very large size, and containing RNA as well as covalently bound ligands. The method should streamline the cryo-EM structure determination process, providing accurate and unbiased atomic structure interpretation of such maps.

ABSTRACT Cellular cryo-electron tomography (cryo-ET) enables 3-dimensional reconstructions of organelles in their native cellular environment at subnanometer resolution. However, quantifying ultrastructural features of pleomorphic organelles in three dimensions is challenging, as is defining the significance of observed changes induced by specific cellular perturbations. To address this challenge, we established a semi-automated workflow to segment organellar membranes and reconstruct their underlying surface geometry in cryo-ET. To complement this workflow, we developed an open source suite of ultrastructural quantifications, integrated into a single pipeline called the surface morphometrics toolkit. This toolkit allows detailed mapping of spacing, curvature, and orientation onto reconstructed membrane meshes, highlighting subtle organellar features that are challenging to detect in three dimensions and allowing for statistical comparison across many organelles. To demonstrate the advantages of this approach, we combine cryo-ET with cryo-fluorescence microscopy to correlate bulk mitochondrial network morphology (i.e., elongated versus fragmented) with membrane ultrastructure of individual mitochondria in the presence and absence of endoplasmic reticulum (ER) stress. Using our toolkit, we demonstrate ER stress promotes adaptive remodeling of ultrastructural features of mitochondria including spacing between the inner and outer membranes, local curvature of the inner membrane, and spacing between mitochondrial cristae. We show that differences in membrane ultrastructure correlate to mitochondrial network morphologies, suggesting that these two remodeling events are coupled. Our toolkit offers opportunities for quantifying changes in organellar architecture on a single-cell level using cryo-ET, opening new opportunities to define changes in ultrastructural features induced by diverse types of cellular perturbations.

Summary Understanding and controlling protein motion at atomic resolution is a hallmark challenge for structural biologists and protein engineers because conformational dynamics are essential for complex functions such as enzyme catalysis and allosteric regulation. Time-resolved crystallography offers a window into protein motions, yet without a universal perturbation to initiate conformational changes the method has been limited in scope. Here we couple a solvent-based temperature jump with time-resolved crystallography to visualize structural motions in lysozyme, a dynamic enzyme. We observed widespread atomic vibrations on the nanosecond timescale, which evolve on the sub-millisecond timescale into localized structural fluctuations that are coupled to the active site. An orthogonal perturbation to the enzyme, inhibitor binding, altered these dynamics by blocking key motions that allow energy to dissipate from vibrations into functional movements linked to the catalytic cycle. Because temperature-jump is a universal method for perturbing molecular motion, the method demonstrated here is broadly applicable for studying protein dynamics.

Abstract Mitochondrial fission is required for proper segregation during cell division, quality control, and cellular homeostasis (metabolism and energy production). Despite its importance, models of the process remain speculative. Here we apply cryogenic electron tomography to image the nanoscale architecture of mitochondrial fission in mammalian cells. We find that constriction of the inner and outer membranes is coordinated, suggesting that force on both membranes is applied externally. While we observe ER at constriction sites, it did not encircle constrictions. Instead, we find long bundles of both unbranched actin and septin filaments enriched at constrictions. Actin bundles align with the central region of division bridges and septin bundles with the necks on either side. Septin bundles appear to guide microtubules to constriction sites, suggesting, along with autolysosomes observed in the vicinity, a pathway for mitophagy. Together, our results rule out several existing models for mitochondrial fission and provide empirical parameters to inform the development of realistic coarse-grained models in the future.

Abstract This paper describes outcomes of the 2019 Cryo-EM Map-based Model Metrics Challenge sponsored by EMDataResource ( www.emdataresource.org ). The goals of this challenge were (1) to assess the quality of models that can be produced using current modeling software, (2) to check the reproducibility of modeling results from different software developers and users, and (3) compare the performance of current metrics used for evaluation of models. The focus was on near-atomic resolution maps with an innovative twist: three of four target maps formed a resolution series (1.8 to 3.1 Å) from the same specimen and imaging experiment. Tools developed in previous challenges were expanded for managing, visualizing and analyzing the 63 submitted coordinate models, and several novel metrics were introduced. The results permit specific recommendations to be made about validating near-atomic cryo-EM structures both in the context of individual laboratory experiments and holdings of structure data archives such as the Protein Data Bank. Our findings demonstrate the relatively high accuracy and reproducibility of cryo-EM models derived from these benchmark maps by 13 participating teams, representing both widely used and novel modeling approaches. We also evaluate the pros and cons of the commonly used metrics to assess model quality and recommend the adoption of multiple scoring parameters to provide full and objective annotation and assessment of the model, reflective of the observed density in the cryo-EM map.

Advances in electron cryomicroscopy allow for the building of de novo atomic models into high resolution Coulomb potential maps. While established validation metrics independently assess map quality and model geometry, methods to assess the precise fitting of an atomic model into the map and to validate the interpretation of high resolution features are less well developed. Here, we present EMRinger, which tests model-to-map agreement using side-chain dihedral-directed map density measurements. These measurements reveal local map density peaks and show that peaks located at rotameric angles are a sensitive marker of whether the backbone is correctly positioned. The EMRinger Score can be improved by model refinement, suggesting its utility as an effective model-to-map validation metric. Additionally, EMRinger sampling identifies how radiation damage alters scattering from negatively charged amino acids during data collection. EMRinger will be useful in assessing how advances in cryo-EM increase the ability to resolve and model high-resolution features.

Abstract Chitin is an abundant polysaccharide used by a large range of organisms for structural rigidity and water repulsion. As such, the insoluble crystalline structure of chitin poses significant challenges for enzymatic degradation. Vertebrates do not produce chitin, but do express chitin degrading enzymes. Acidic mammalian chitinase, the primary enzyme involved in the degradation of environmental chitin in mammalian lungs, is a processive glycosyl hydrolase that may be able to make multiple hydrolysis events for each binding event. Mutations to acidic mammalian chitinase have been associated with asthma, and genetic deletion of the enzyme in mice results in significantly increased morbidity and mortality with age. We initially set out to reverse this phenotype by engineering hyperactive acidic mammalian chitinase variants. Using a directed evolution screening approach using commercial fluorogenic substrates, we identified mutations with consistent increases in activity. To determine whether the activity increases observed with oligomeric substrates were consistent with more biologically relevant chitin substrates, we developed new assays to quantify chitinase activity with colloidal crystalline chitin, and identified a high throughput fluorogenic assay that gives sufficient signal to noise advantages to quantify changes to activity due to the addition or removal of a chitin binding domain to the enzyme. We show that the activity increasing mutations derived from our directed evolution screen were lost when crystalline substrates were used. In contrast, naturally occurring gain-of-function mutations gave similar results with oligomeric and crystalline substrates. We also show that the activity differences between acidic mammalian chitinase and chitotriosidase are reduced in the context of crystalline substrate, suggesting that previously reported activity differences with oligomeric substrates may have been largely driven by differential substrate specificity for the oligomers. These results highlight the need for assays against more physiological substrates when engineering complex metabolic enzymes, and provide a new approach that may be broadly applicable to engineering glycosyl hydrolases.

Cryo-EM has revealed many challenging yet exciting macromolecular assemblies at near-atomic resolution (3-4.5 Angstrom), providing biological phenomena with molecular descriptions. However, at these resolutions accurately positioning individual atoms remains challenging and may be error-prone. Manually refining thousands of amino acids -- typical in a macromolecular assembly -- is tedious and time-consuming. We present an automated method that can improve the atomic details in models manually built in near-atomic-resolution cryo-EM maps. Applying the method to three systems recently solved by cryo-EM, we are able to improve model geometry while maintaining or improving the fit-to-density. Backbone placement errors are automatically detected and corrected, and the refinement shows a large radius of convergence. The results demonstrate the method is amenable to structures with symmetry, of very large size, and containing RNA as well as covalently bound ligands. The method should streamline the cryo-EM structure determination process, providing accurate and unbiased atomic structure interpretation of such maps.