Abstract Collagen-producing cells maintain the complex architecture of the lung and drive pathologic scarring in pulmonary fibrosis. Here we perform single-cell RNA-sequencing to identify all collagen-producing cells in normal and fibrotic lungs. We characterize multiple collagen-producing subpopulations with distinct anatomical localizations in different compartments of murine lungs. One subpopulation, characterized by expression of Cthrc1 (collagen triple helix repeat containing 1), emerges in fibrotic lungs and expresses the highest levels of collagens. Single-cell RNA-sequencing of human lungs, including those from idiopathic pulmonary fibrosis and scleroderma patients, demonstrate similar heterogeneity and CTHRC1 -expressing fibroblasts present uniquely in fibrotic lungs. Immunostaining and in situ hybridization show that these cells are concentrated within fibroblastic foci. We purify collagen-producing subpopulations and find disease-relevant phenotypes of Cthrc1 -expressing fibroblasts in in vitro and adoptive transfer experiments. Our atlas of collagen-producing cells provides a roadmap for studying the roles of these unique populations in homeostasis and pathologic fibrosis.

Resident memory T cells (TRM cells) are an important first-line defense against respiratory pathogens, but the unique contributions of lung TRM cell populations to protective immunity and the factors that govern their localization to different compartments of the lung are not well understood. Here, we show that airway and interstitial TRM cells have distinct effector functions and that CXCR6 controls the partitioning of TRM cells within the lung by recruiting CD8 TRM cells to the airways. The absence of CXCR6 significantly decreases airway CD8 TRM cells due to altered trafficking of CXCR6−/− cells within the lung, and not decreased survival in the airways. CXCL16, the ligand for CXCR6, is localized primarily at the respiratory epithelium, and mice lacking CXCL16 also had decreased CD8 TRM cells in the airways. Finally, blocking CXCL16 inhibited the steady-state maintenance of airway TRM cells. Thus, the CXCR6/CXCL16 signaling axis controls the localization of TRM cells to different compartments of the lung and maintains airway TRM cells.

Abstract Fibroblasts substantially remodel extracellular matrix (ECM) in response to tissue injury and generate fibrotic scars in chronic diseases. Recent studies have identified diverse fibroblast subsets in healthy and injured tissues. However, the origin(s) and functional importance of injury-induced fibroblast lineages remain unclear. Here we show that alveolar fibroblasts, which provide a niche for maintaining alveolar type 2 cells in uninjured lungs, are the dominant source of multiple emergent fibroblast subsets that sequentially arise to facilitate fibrosis after lung injury. We demonstrate that Cthrc1+ fibroblasts, which express the highest levels of ECM proteins at injured sites, are effector cells for fibrogenesis using a novel mouse tool, Cthrc1-CreER. We use another novel mouse tool, Scube2-CreER, that uniquely targets alveolar fibroblasts, to reveal that alveolar fibroblasts are the dominant origin for multiple fibroblast subsets that emerge after lung injury. Pseudotime and in vitro analysis suggest that inflammatory cytokines initially induce chemokine-producing inflammatory fibroblasts from alveolar fibroblasts, which can differentiate into Cthrc1+ fibrotic fibroblasts in response to TGF-β. We identify similar fibroblast lineages from scRNA-seq in human pulmonary fibrosis. These results elucidate the pathologic fibroblast lineage development in response to lung injury and suggest that targeting key steps in transitions among these subsets could provide novel strategies for the treatment of fibrotic diseases.

Abstract The αvβ8 integrin is a key activator of transforming growth factor β (TGF β), which has been shown to inhibit anti-tumor immunity. Previous work has suggested that αvβ8 on tumor cells could modulate tumor growth and responses to immune checkpoint blockade. We now show that a potent blocking monoclonal antibody against αvβ8 (ADWA-11) causes growth suppression or complete regression in syngeneic models of squamous cell carcinoma (CCK168), mammary cancer (EMT-6), colon cancer (CT26), and prostate cancer (TRAMPC2), especially when it is combined with other immunomodulators (anti-PD-1, anti-CTLA-4 or 4-1BB) or radiotherapy. αvβ8 is expressed on tumor cells in some of these models, but tumor cell expression of αvβ8 is not essential for the beneficial effects of ADWA-11 therapy. αvβ8 is consistently expressed at highest levels on CD4+CD25+ T cells within tumors, and specific deletion of Itgb8 from T cells is as effective as ADWA-11 in suppressing tumor growth. Treatment with ADWA-11 increases expression of a suite of genes in tumor infiltrating CD8+ T cells that are normally inhibited by TGFβ and are involved in tumor cell killing, including Granzyme B and Interferon-γ. These findings solidify αvβ8 integrin as a promising target for cancer immunotherapy, even for tumors that do not express this integrin.

Collagen is the most abundant protein in animals. Its dysregulation contributes to ageing and many human disorders, including tissue fibrosis in major organs. How premature collagen proteins in the endoplasmic reticulum (ER) assemble and route for secretion remains molecularly undefined. From an RNAi screen, we identified an uncharacterized C. elegans gene tmem-131, deficiency of which impairs collagen production and activates ER stress response. We found that N-termini of human TMEM131 contain bacterial PapD chaperone-like (PapD-L) domains, which recruit premature collagen monomers for proper assembly and secretion. C-termini of TMEM131 interact with TRAPPC8, a component of the TRAPP tethering complex, to drive collagen cargo trafficking from ER to the Golgi. We provide evidence that previously undescribed roles of TMEM131 in collagen recruitment and secretion are evolutionarily conserved in C. elegans, Drosophila and humans.

Summary When monocyte-derived macrophages are recruited to injured tissues, they can induce a maladaptive fibrotic response characterized by excessive production of fibrillar collagen from local fibroblasts. Macrophages initiate the fibrotic programming of fibroblasts via paracrine factors, but it is unclear if reciprocal responses from the fibroblasts trigger pro-fibrotic programming of macrophages to establish a collaborative feed-forward fibrotic circuit. We identify macrophage-fibroblast cross talk necessary for injury-associated fibrosis, in which macrophages induce interleukin 6 ( IL-6 ) expression in fibroblasts via purinergic receptor P2rx4 signaling and IL-6 induces arginase 1 ( Arg1 ) expression in macrophages. Surprisingly, Arg1 contributes to fibrotic responses by metabolizing arginine to ornithine, which fibroblasts use as a substrate to synthesize proline, a uniquely abundant constituent of fibrillar collagen. Taken together, we define a bidirectional circuit between macrophages and fibroblasts that facilitates cross-feeding metabolism necessary for injury-associated fibrosis.

Fibroblasts coordinate the response to tissue injury, directing organ regeneration versus scarring. In the central nervous system (CNS), fibroblasts are uncommon cells enriched at tissue borders, and their molecular, cellular, and functional interactions after brain injury are poorly understood. Here we define the fibroblast response to sterile brain damage across time and space. Early pro-fibrotic myofibroblasts infiltrated CNS lesions and were functionally and spatially organized by fibroblast TGF β signaling, pro-fibrotic macrophages and microglia, and perilesional brain glia that activated TGF β via integrin α v β 8 . Early myofibroblasts subsequently transitioned into a variety of late states, including meningeal and lymphocyte-interactive fibroblasts that persisted long term. Interruption of this dynamic fibroblast-macrophage-glial coordination impaired brain wound healing and the resolution of neuroinflammation, disrupted generation of late de novo CNS lymphocyte niches, and increased mortality in a stroke model. This work highlights an unexpected role of fibroblasts as coordinate regulators of CNS healing and neuroinflammation after brain injury.

Organ fibrosis is often accompanied by aberrant epithelial reprogramming, culminating in a transformed barrier composed of scar and metaplastic epithelium. Understanding how the scar promotes an abnormal epithelial response could better inform strategies to reverse the fibrotic damage. Here we show that Gli1+ mesenchymal stromal cells (MSCs), previously shown to contribute to myofibroblasts in the scar, promote metaplastic differentiation of airway progenitors into KRT5+ basal cells in vitro and in vivo. During fibrotic repair, Gli1+ MSCs integrate hedgehog activation to promote metaplastic KRT5 differentiation by upregulating BMP antagonism in the progenitor niche. Restoring the balance towards BMP activation attenuated metaplastic KRT5+ differentiation while promoting adaptive alveolar differentiation. Finally, fibrotic human lungs demonstrate altered BMP activation in the metaplastic epithelium. These findings show that Gli1+ MSCs integrate hedgehog signaling as a rheostat to control BMP activation in the progenitor niche to determine regenerative outcome in fibrosis.

Abstract Premature infants with bronchopulmonary dysplasia (BPD) have impaired alveolar gas exchange due to alveolar simplification and dysmorphic pulmonary vasculature. Advances in clinical care have improved survival for infants with BPD, but the overall incidence of BPD remains unchanged because we lack specific therapies to prevent this disease. Recent work has suggested a role for increased transforming growth factor-beta (TGFβ) signaling and myofibroblast populations in BPD pathogenesis, but the functional significance of each remains unclear. Here, we utilize multiple murine models of alveolar simplification and comparative single-cell RNA sequencing to identify shared mechanisms that could contribute to BPD pathogenesis. Single-cell RNA sequencing reveals a profound loss of myofibroblasts in two models of BPD and identifies gene expression signatures of increased TGFβ signaling, cell cycle arrest, and impaired proliferation in myofibroblasts. Using pharmacologic and genetic approaches, we find no evidence that increased TGFβ signaling in the lung mesenchyme contributes to alveolar simplification. In contrast, this is likely a failed compensatory response, since none of our approaches to inhibit TGFb signaling protect mice from alveolar simplification due to hyperoxia while several make simplification worse. In contrast, we find that impaired myofibroblast proliferation is a central feature in several murine models of BPD, and we show that inhibiting myofibroblast proliferation is sufficient to cause pathologic alveolar simplification. Our results underscore the importance of impaired myofibroblast proliferation as a central feature of alveolar simplification and suggest that efforts to reverse this process could have therapeutic value in BPD.