SUMMARY Variation in the human genome contributes to abundant diversity in human traits and vulnerabilities, but the underlying molecular and cellular mechanisms are not yet known, and will need scalable approaches to accelerate their recognition. Here, we advanced and applied an experimental platform that analyzes genetic, molecular, and phenotypic heterogeneity across cells from very many human donors cultured in a single, shared in vitro environment, with algorithms (Dropulation and Census-seq) for assigning phenotypes to individual donors. We used natural genetic variation and synthetic (CRISPR-Cas9) genetic perturbations to analyze the vulnerability of neural progenitor cells to infection with Zika virus. These analyses identified a common variant in the antiviral IFITM3 gene that regulated IFITM3 expression and explained most inter-individual variation in NPCs’ susceptibility to Zika virus infectivity. These and other approaches could provide scalable ways to recognize the impact of genes and genetic variation on cellular phenotypes. HIGHLIGHTS Measuring cellular phenotypes in iPSCs and hPSC-derived NPCs from many donors Effects of donor sex, cell source, genetic and other variables on hPSC RNA expression Natural genetic variation and synthetic perturbation screens both identify IFITM3 in NPC susceptibility to Zika virus A common genetic variant in IFITM3 explains most inter-individual variation in NPC susceptibility to Zika virus

Abstract The morphology of cells is dynamic and mediated by genetic and environmental factors. Characterizing how genetic variation impacts cell morphology can provide an important link between disease association and cellular function. Here, we combined genomic and high-content imaging approaches on iPSCs from 297 unique donors to investigate the relationship between genetic variants and cellular morphology to map what we term cell morphological quantitative trait loci (cmQTLs). We identified novel associations between rare protein altering variants in WASF2, TSPAN15 , and PRLR with several morphological traits related to cell shape, nucleic granularity, and mitochondrial distribution. Knockdown of these genes by CRISPRi confirmed their role in cell morphology. Analysis of common variants yielded one significant association and nominated over 300 variants with suggestive evidence (P<10 -6 ) of association with one or more morphology traits. Our results showed that, similar to other molecular phenotypes, morphological profiling can yield insight about the function of genes and variants.

Abstract The maturation of neurons and the development of synapses – while emblematic of neurons – also rely on interactions with astrocytes and other glia. To study the role of glia-neuron interactions, we analyzed the transcriptomes of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neurons, from a total of 80 human donors, that were cultured with or without contact with glial cells. We found that the presence of astrocytes enhanced synaptic gene-expression programs in neurons. These changes in neuronal synaptic gene expression correlated with increased expression in the co-cultured glia of genes that encode synaptic cell adhesion molecules, and they were greatly enhanced in the glia in coculture. Both the neuronal and astrocyte gene-expression programs were enriched for genes that are linked to schizophrenia risk. Physical contact between the two cell types was required for the induction of synaptic programs in neurons. Our results suggest that astrocyte-expressed genes with synaptic functions are associated with stronger expression of synaptic genetic programs in neurons and suggest a potential role for astrocyte-neuron interactions in schizophrenia.

ABSTRACT Astrocytes play essential roles in normal brain function, with dysfunction implicated in diverse developmental and degenerative disease processes. Emerging evidence of profound species divergent features of astrocytes coupled with the relative inaccessibility of human brain tissue underscore the utility of human pluripotent stem cell (hPSC) technologies for the generation and study of human astrocytes. However, existing approaches for hPSC-astrocyte generation are typically lengthy, incompletely characterized, or require intermediate purification steps, limiting their utility for multi-cell line, adequately powered functional studies. Here, we establish a rapid and highly scalable method for generating functional human induced astrocytes (hiAs) based upon transient Neurogenin 2 (NGN2) induction of neural progenitor-like cells followed by maturation in astrocyte media, which demonstrate remarkable homogeneity within the population and across 11 independent cell lines in the absence of additional purification steps. These hiAs express canonical astrocyte markers, respond to pro-inflammatory stimuli, exhibit ATP-induced calcium transients and support neuronal maturation in vitro . Moreover, single-cell transcriptomic analyses reveal the generation of highly reproducible cell populations across individual donors, most closely resembling human fetal astrocytes, and highly similar to hPSC-derived astrocytes generated using more complex approaches. Finally, the hiAs capture key molecular hallmarks in a trisomy 21 disease model. Thus, hiAs provide a valuable and practical resource well-suited for study of basic human astrocyte function and dysfunction in disease.

Abstract To study how the 22q11.2 deletion predisposes to psychiatric disease, we generated induced pluripotent stem cells from deletion carriers and controls, as well as utilized CRISPR/Cas9 to introduce the heterozygous deletion into a control cell line. Upon differentiation into neural progenitor cells, we found the deletion acted in trans to alter the abundance of transcripts associated with risk for neurodevelopmental disorders including Autism Spectrum Disorder. In more differentiated excitatory neurons, altered transcripts encoded presynaptic factors and were associated with genetic risk for schizophrenia, including common (per-SNP heritability p ( τ c )= 4.2 x 10 -6 ) and rare, loss of function variants (p = 1.29×10 -12 ). These findings suggest a potential relationship between cellular states, developmental windows and susceptibility to psychiatric conditions with different ages of onset. To understand how the deletion contributed to these observed changes in gene expression, we developed and applied PPItools, which identifies the minimal protein-protein interaction network that best explains an observed set of gene expression alterations. We found that many of the genes in the 22q11.2 interval interact in presynaptic, proteasome, and JUN/FOS transcriptional pathways that underlie the broader alterations in psychiatric risk gene expression we identified. Our findings suggest that the 22q11.2 deletion impacts genes and pathways that may converge with risk loci implicated by psychiatric genetic studies to influence disease manifestation in each deletion carrier.

Cellular perturbations underlying Alzheimer's disease are primarily studied in human postmortem samples and model organisms. Here we generated a single-nucleus atlas from a rare cohort of cortical biopsies from living individuals with varying degrees of Alzheimer's disease pathology. We next performed a systematic cross-disease and cross-species integrative analysis to identify a set of cell states that are specific to early AD pathology. These changes-which we refer to as the Early Cortical Amyloid Response-were prominent in neurons, wherein we identified a transient state of hyperactivity preceding loss of excitatory neurons, which correlated with the selective loss of layer 1 inhibitory neurons. Microglia overexpressing neuroinflammatory-related processes also expanded as AD pathological burden increased. Lastly, both oligodendrocytes and pyramidal neurons upregulated genes associated with amyloid beta production and processing during this early hyperactive phase. Our integrative analysis provides an organizing framework for targeting circuit dysfunction, neuroinflammation, and amyloid production early in AD pathogenesis.

Abstract Inter-individual genetic variation affects the susceptibility to and progression of many diseases. Efforts to study the molecular mechanisms mediating the impact of human genetic variation on normal development and disease phenotypes are limited, however, by the paucity of faithful cellular human models, and the difficulty of scaling current systems to represent multiple individuals. Here, we present human brain “Chimeroids”, a highly reproducible, multi-donor human brain cortical organoid model generated by the co-development of cells from a panel of individual donors in a single organoid, while maintaining fidelity to endogenous tissue. By reaggregating cells from multiple single-donor organoids at the neural stem or committed progenitor cell stage, we generate Chimeroids in which each donor produces all cell lineages of the cerebral cortex, even when using pluripotent stem cell lines with notable growth biases. We leveraged Chimeroids to investigate inter-individual variation in susceptibility to neurotoxic stressors that exhibit high clinical phenotypic variability: ethanol and the anti-epileptic drug valproic acid. Individual donors varied in both the penetrance of the effect on target cell types, and the molecular phenotype within each affected cell type. Our results show that human genetic background may be an important mediator of neurotoxin susceptibility and introduce Chimeroids as a scalable system for high-throughput investigation of the contribution of human genetic variation to brain development and disease.

Abstract Single-cell transcriptomics, in conjunction with genetic and compound perturbations, offers a robust approach for exploring cellular behaviors in diverse contexts. Such experiments allow un-covering cell-state-specific responses to perturbations, a crucial aspect in unraveling the intricate molecular mechanisms governing cellular behavior and potentially discovering novel regulatory pathways and therapeutic targets. However, prevailing computational methods predominantly focus on predicting average cellular responses, disregarding the inherent response heterogeneity associated with cell state diversity. In this study, we present CellCap, a deep generative model designed for the end-to-end analysis of single-cell perturbation experiments. CellCap employs sparse dictionary learning in a latent space to deconstruct cell-state-specific perturbation responses into a set of transcriptional response programs. These programs are then utilized by each perturbation condition and each cell at varying degrees. The incorporation of specific model design choices, such as dot-product cross-attention between cell states and response programs, along with a linearly-decoded latent space, underlay the interpretation power of CellCap. We evaluate CellCap’s model interpretability through multiple simulated scenarios and apply it to two real single-cell perturbation datasets. These datasets feature either heterogeneous cellular populations or a complex experimental setup. Our results demonstrate that CellCap successfully uncovers the relationship between cell state and perturbation response, unveiling novel insights overlooked in previous analyses. The model’s interpretability, coupled with its effectiveness in capturing heterogeneous responses, positions CellCap as a valuable tool for advancing our understanding of cellular behaviors in the context of perturbation experiments.