Abstract Gap junction channels (GJCs) mediate intercellular communication by connecting two neighboring cells and enabling direct exchange of ions and small molecules. Cell coupling via connexin-43 (Cx43) GJCs is important in a wide range of cellular processes in health and disease 1-3 , yet the structural basis of Cx43 function and regulation has not been determined until now. Here we describe the structure of a human Cx43 GJC solved by cryo-EM and single particle analysis at 2.26 Å resolution. The pore region of Cx43 GJC features several lipid-like densities per Cx43 monomer, located close to a putative lateral access site at the monomer boundary. We found a previously undescribed conformation on the cytosolic side of the pore, formed by the N-terminal domain and the transmembrane helix 2 of Cx43 and stabilized by a small molecule. Structures of the Cx43 GJC and hemichannels in nanodiscs reveal a similar gate arrangement. The features of the Cx43 GJC and hemichannel cryo-EM maps and the channel properties revealed by molecular dynamics simulations suggest that the captured states of Cx43 are consistent with a closed state.

Abstract Protein–protein interactions (PPIs) mediate numerous essential functions and regulatory events in living organisms. The physical interactome of a protein can be abnormally altered in response to external and internal cues, thus modulating cell physiology and contributing to human disease. In particular, neurodegenerative diseases due to the accumulation of aberrantly folded and aggregated proteins may lead to alterations in protein interactomes. Identifying changes in the interactomes of normal and disease states of proteins could help to understand molecular disease mechanisms, but current interactomics methods are limited in the ability to pinpoint structure-specific PPIs and their interaction interfaces on a proteome-wide scale. Here, we adapted limited proteolysis–mass spectrometry (LiP–MS) to systematically identify putative structure-specific PPIs by probing protein structural alterations within cellular extracts upon treatment with specific structural states of a given protein. We demonstrate the feasibility of our method to detect well-characterized PPIs, including antibody–target protein interactions and interactions with membrane proteins, and show that it pinpoints PPI interfaces. We then applied the LiP–MS approach to study the structure-specific interactors of the Parkinson’s disease hallmark protein alpha-synuclein (aSyn). We identified several previously known interactors of both aSyn monomer and amyloid fibrils and provide a resource of novel putative structure-specific interactors for further studies. This approach is applicable to identify structure-specific interactomes of any protein, including posttranslationally modified and unmodified, or metabolite-bound and unbound structural states of proteins.

Abstract In myelinating Schwann cells, communication between myelin layers is mediated by gap junction channels (GJC) formed by docked connexin 32 hemichannels (HCs). Mutations in Cx32 cause the X-linked Charcot–Marie–Tooth disease (CMT1X), a degenerative neuropathy with no cure. A molecular link between Cx32 dysfunction and CMT1X pathogenesis is still missing. Here, we describe the high resolution cryo-EM structures of the Cx32 GJC and HC, along with two CMT1X-linked mutants, W3S and R22G. While the structures of wild-type and mutant GJCs are virtually identical, the HCs show a major difference: in the W3S and R22G mutant HCs, the N-terminal helix partially occludes the pore, consistent with an impaired HC activity. Our results suggest that HC dysfunction may be involved in the pathogenesis of CMT1X. One-Sentence Summary Connexin 32 channel structures reveal a gating helix defect in CMT1X disease-associated mutant hemichannels

Abstract Connexin gap junction channels and hemichannels play important roles in intercellular communication and signaling. Some of connexin isoforms are associated with diseases, including hereditary neuropathies, heart disease and cancer. Although small molecule inhibitors of connexins show promise as therapeutic agents, the molecular mechanisms of connexin channel inhibition are unknown. Here, we report the cryo-EM structure of connexin-36 (Cx36) bound to an anti-malarial drug mefloquine at 2.1 Å resolution. Six drug binding sites partially occlude the pore of each connexon forming the channel. Each drug molecule in the ring makes contacts with residues in the pore-lining pocket and with the neighbouring mefloquine molecules, partially occluding the pore and modifying the pore electrostatics, ultimately reducing solute translocation through the channel. Structures of Cx36 in the presence of quinine and quinidine show a similar mode of drug binding. Molecular dynamics simulations of Cx36 bound to mefloquine show that drug binding affects the kinetics of ion passage through the pore. This previously undescribed mode of connexin channel inhibition presents an opportunity for designing subtype-specific connexin inhibitors. One-sentence summary Mechanism of connexin channel inhibition by small molecules

Abstract Membrane adenylyl cyclase AC8 is regulated by G proteins and calmodulin (CaM), mediating the crosstalk between the cAMP pathway and Ca 2+ signalling. Despite the importance of AC8 in physiology, including cognitive functions and memory, the structural basis of its regulation by G proteins and CaM is not well defined. Here we report the 3.5 Å resolution cryo-EM structure of the bovine AC8 bound to Ca 2+ /CaM and the stimulatory Gαs protein. The structure reveals the architecture of the ordered AC8 domains bound to Gαs and a small molecule activator forskolin. The extracellular surface of AC8 features a negatively charged pocket, a potential site for unknown interactors. Despite the well resolved forskolin density, the captured state of AC8 does not favour tight nucleotide binding. The structural proteomics approaches, limited proteolysis and crosslinking mass spectrometry, allow us to identify the contact sites between AC8 and its regulators, CaM, Gαs, and Gβγ, as well as to infer the conformational changes induced by these interactions. Our results provide a framework for understanding the role of flexible regions in the mechanism of AC regulation.

Abstract Mycobacterium tuberculosis adenylyl cyclase (AC) Rv1625c / Cya is an evolutionary ancestor of the mammalian membrane ACs and a model system for studies of their structure and function. Although the vital role of ACs in cellular signaling is well established, the function of their transmembrane (TM) regions remains unknown. Here we describe the cryo-EM structure of Cya bound to a stabilizing nanobody at 3.6 Å resolution. The TM helices 1-5 form a structurally conserved domain that facilitates the assembly of the helical and catalytic domains. The TM region contains discrete pockets accessible from the extracellular and cytosolic side of the membrane. Neutralization of the negatively charged extracellular pocket Ex1 destabilizes the cytosolic helical domain and reduces the catalytic activity of the enzyme. The TM domain acts as a functional component of Cya, guiding the assembly of the catalytic domain and providing the means for direct regulation of catalytic activity in response to extracellular ligands. One-Sentence Summary Structure of M. tuberculosis membrane adenylyl cyclase Cya