Beware of T cells that don't know how to stop During an infection, T cells divide extensively and secrete proteins that can severely damage tissues. But T cells know when to stop—they express proteins on their surface such as CTLA4, which put on the brakes. Kuehn et al. now report genetic evidence of the importance of CTLA4 in humans (see the Perspective by Rieux-Laucat and Casanova). They identified six patients with mutations in one copy of CTLA4 . Patients presented with symptoms of an overzealous immune response, with immune cells infiltrating their organs. The findings support the idea that CTLA4 tells the immune system when enough is enough. Science , this issue p. 1623 ; see also p. 1560

Abstract Neutrophil chemotaxis to sites of inflammation is a critical process during normal immune responses to tissue injury and infection and pathological immune responses leading to chronic inflammation. Although progress has been made in understanding the mechanisms that promote neutrophil recruitment to inflamed tissue, the mechanisms that regulate the resolution phase of the inflammatory response have remained relatively elusive. To define the mechanisms that regulate neutrophil-mediated inflammation in vivo, we have developed a novel transgenic zebrafish in which the neutrophils express GFP under control of the myeloperoxidase promoter (zMPO:GFP). Tissue injury induces a robust, inflammatory response, which is characterized by the rapid chemotaxis of neutrophils to the wound site. In vivo time-lapse imaging shows that neutrophils subsequently display directed retrograde chemotaxis back toward the vasculature. These findings implicate retrograde chemotaxis as a novel mechanism that regulates the resolution phase of the inflammatory response. The zMPO:GFP zebrafish provides unique insight into the mechanisms of neutrophil-mediated inflammation and thereby offers opportunities to identify new regulators of the inflammatory response in vivo.

The Src family kinase Lyn is identified as a physiological redox sensor that mediates the initial attraction of leukocytes to wounds in zebrafish larvae. It is known that hydrogen peroxide (H2O2) — often an ingredient in over-the-counter medicines for cleaning cuts — is generated at injured tissue and that it attracts immune cells (neutrophils) that promote wound healing. How immune cells sense the H2O2 secreted from wounds was not known. This study identifies an Src family kinase, Lyn, as a redox sensor that mediates initial neutrophil recruitment. Exposure to H2O2 directly oxidizes a single cysteine residue is indispensable in Lyn, and inhibition of Lyn attenuates neutrophil wound recruitment. Tissue wounding induces the rapid recruitment of leukocytes1. Wounds and tumours—a type of ‘unhealed wound’2—generate hydrogen peroxide (H2O2) through an NADPH oxidase (NOX). This extracellular H2O2 mediates recruitment of leukocytes, particularly the first responders of innate immunity, neutrophils, to injured tissue3,4,5,6. However, the sensor that neutrophils use to detect the redox state at wounds is unknown. Here we identify the Src family kinase (SFK) Lyn as a redox sensor that mediates initial neutrophil recruitment to wounds in zebrafish larvae. Lyn activation in neutrophils is dependent on wound-derived H2O2 after tissue injury, and inhibition of Lyn attenuates neutrophil wound recruitment. Inhibition of SFKs also disrupted H2O2-mediated chemotaxis of primary human neutrophils. In vitro analysis identified a single cysteine residue, C466, as being responsible for direct oxidation-mediated activation of Lyn. Furthermore, transgenic-tissue-specific reconstitution with wild-type Lyn and a cysteine mutant revealed that Lyn C466 is important for the neutrophil wound response and downstream signalling in vivo. This is the first identification, to our knowledge, of a physiological redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in multicellular organisms.

Integrin receptors play an important role during cell migration by mediating linkages and transmitting forces between the extracellular matrix and the actin cytoskeleton. The mechanisms by which these linkages are regulated and released during migration are not well understood. We show here that cell-permeable inhibitors of the calcium-dependent protease calpain inhibit both beta1 and beta3 integrin-mediated cell migration. Calpain inhibition specifically stabilizes peripheral focal adhesions, increases adhesiveness, and decreases the rate of cell detachment. Furthermore, these inhibitors alter the fate of integrin receptors at the rear of the cell during migration. A Chinese hamster ovary cell line expressing low levels of calpain I also shows reduced migration rates with similar morphological changes, further implicating calpain in this process. Taken together, the data suggest that calpain inhibition modulates cell migration by stabilizing cytoskeletal linkages and decreasing the rate of retraction of the cell's rear. Inhibiting calpain-mediated proteolysis may therefore be a potential therapeutic approach to control pathological cell migration such as tumor metastasis.

Cell polarity is crucial for directed migration. Here we show that phosphoinositide 3-kinase (PI(3)K) mediates neutrophil migration in vivo by differentially regulating cell protrusion and polarity. The dynamics of PI(3)K products PI(3,4,5)P(3)-PI(3,4)P(2) during neutrophil migration were visualized in living zebrafish, revealing that PI(3)K activation at the leading edge is critical for neutrophil motility in intact tissues. A genetically encoded photoactivatable Rac was used to demonstrate that localized activation of Rac is sufficient to direct migration with precise temporal and spatial control in vivo. Similar stimulation of PI(3)K-inhibited cells did not direct migration. Localized Rac activation rescued membrane protrusion but not anteroposterior polarization of F-actin dynamics of PI(3)K-inhibited cells. Uncoupling Rac-mediated protrusion and polarization suggests a paradigm of two-tiered PI(3)K-mediated regulation of cell motility. This work provides new insight into how cell signaling at the front and back of the cell is coordinated during polarized cell migration in intact tissues within a multicellular organism.

Abstract Aspergillus nidulans is an opportunistic fungal pathogen in patients with immunodeficiency and virulence of A. nidulans isolates has mainly been studied in the context of the chronic granulomatous disease (CGD), with characterization of clinical isolates obtained from non-CGD patients remaining elusive. This study therefore carried out a detailed biological characterization of two A. nidulans clinical isolates (CIs), obtained from a patient with breast carcinoma and pneumonia and from a patient with cystic fibrosis that underwent lung transplantation, and compared them to the reference, non-clinical A4 strain. Both CIs presented increased growth in comparison to the reference strain in the presence of physiologically-relevant carbon sources. Metabolomic analyses showed that the three strains are metabolically very different from each other in these carbon sources. Furthermore, the CIs were highly susceptible to cell wall perturbing agents but not to other physiologically-relevant stresses. Genome analyses identified several frame-shift variants in genes encoding cell wall integrity (CWI) signalling components. Significant differences in CWI signalling were confirmed by western blotting among the three strains. In vivo virulence studies using several different models revealed that strain MO80069 had significantly higher virulence in hosts with impaired neutrophil function when compared to the other strains. In summary, this study presents detailed biological characterization of two A. nidulans sensu stricto clinical isolates. Just like in A. fumigatus, strain heterogeneity exists in A. nidulans clinical strains that can define virulence traits. Further studies are required to fully characterize A. nidulans strain-specific virulence traits and pathogenicity. Importance Immunocompromised patients are susceptible to infections with opportunistic filamentous fungi from the genus Aspergillus. Although A. fumigatus is the main etiological agent of Aspergillus spp.-related infections, other species, such as A. nidulans are prevalent in a condition-specific manner. A. nidulans is a predominant infective agent in patients suffering from chronic granulomatous disease (CGD). A. nidulans isolates have mainly been studied in the context of CGD, although infection with A. nidulans also occurs in non-CGD patients. This study carried out a detailed biological characterization of two non-CGD A. nidulans clinical isolates and compared it to a reference strain. Phenotypic, metabolomic and genomic analyses highlight fundamental differences in carbon source utilization, stress responses and maintenance of cell wall integrity among the strains. One clinical strain had increased virulence in models with impaired neutrophil function. Just as in A. fumigatus, strain heterogeneity exists in A. nidulans clinical strains that can define virulence traits.

Single photon avalanche diode (SPAD) array sensors can increase the imaging speed for fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) by transitioning from laser scanning to widefield geometries. While a SPAD camera in epi-fluorescence geometry enables widefield FLIM of fluorescently labeled samples, label-free imaging of single-cell autofluorescence is not feasible in an epi-fluorescence geometry because background fluorescence from out-of-focus features masks weak cell autofluorescence and biases lifetime measurements. Here, we address this problem by integrating the SPAD camera in a light sheet illumination geometry to achieve optical sectioning and limit out-of-focus contributions, enabling fast label-free FLIM of single-cell NAD(P)H autofluorescence. The feasibility of this NAD(P)H light sheet FLIM system was confirmed with time-course imaging of metabolic perturbations in pancreas cancer cells with 10 s integration times, and in vivo NAD(P)H light sheet FLIM was demonstrated with live neutrophil imaging in a zebrafish tail wound, also with 10 s integration times. Finally, the theoretical and practical imaging speeds for NAD(P)H FLIM were compared across laser scanning and light sheet geometries, indicating a 30X to 6X frame rate advantage for the light sheet compared to the laser scanning geometry. This light sheet system provides faster frame rates for 3D NAD(P)H FLIM for live cell imaging applications such as monitoring single cell metabolism and immune cell migration throughout an entire living organism.

Abstract Neutrophils, the most abundant leukocytes in human peripheral circulation, are crucial for the innate immune response. They are typically quiescent but rapidly activate in response to infection and inflammation, performing diverse functions such as oxidative burst, phagocytosis, and NETosis, which require significant metabolic adaptation. Deeper insights into such metabolic changes will help identify regulation of neutrophil functions in health and diseases. Due to their short lifespan and associated technical challenges, the metabolic processes of neutrophils are not completely understood. This study uses optical metabolic imaging (OMI), which entails optical redox ratio and fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsic metabolic coenzymes NAD(P)H and FAD to assess the metabolic state of single neutrophils. Primary human neutrophils were imaged in vitro under a variety of activation conditions and metabolic pathway inhibitors, while metabolic and functional changes were confirmed with mass spectrometry, oxidative burst, and NETosis measurements. Our findings show that neutrophils undergo rapid metabolic remodeling to a reduced redox state, followed by a shift to an oxidized redox state during activation. Additionally, single cell analysis reveals a heterogeneous metabolic response across neutrophils and donors to live pathogen infection ( Pseudomonas aeruginosa and Toxoplasma gondii ). Finally, consistent metabolic changes were validated with neutrophils in vivo using zebrafish larvae. This study demonstrates the potential of OMI as a versatile tool for studying neutrophil metabolism and underscores its use across different biological systems, offering insights into neutrophil metabolic activity and function at a single cell level.

Abstract The effector functions of macrophages across the spectrum of activation states in vitro are linked to profound metabolic rewiring. However, the metabolism of macrophages remains poorly characterized in vivo . To assess changes in the intracellular metabolism of macrophages in their native inflammatory microenvironment, we employed two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) of metabolic coenzymes NAD(P)H and FAD. We found that pro-inflammatory activation of macrophages in vivo was associated with a decrease in the optical redox ratio [NAD(P)H/(NAD(P)H+FAD)] relative to a pro-resolving population during both infected and sterile inflammation. FLIM also resolved temporal changes in the optical redox ratio and lifetime variables of NAD(P)H in macrophages over the course of sterile inflammation. Collectively, we show that non-invasive and label-free imaging of autofluorescent metabolic coenzymes is sensitive to dynamic changes in macrophage activation in interstitial tissues. This imaging-based approach has broad applications in immunometabolism by probing in real time the temporal and spatial metabolic regulation of immune cell function in a live organism. Significance Metabolic regulation of macrophage effector functions has recently emerged as a key concept in immune cell biology. Studies rely on in vitro and ex vivo approaches to study macrophage metabolism, however the high plasticity of these cells suggest that removal from their native microenvironment may induce changes in their intracellular metabolism. Here, we show that fluorescence lifetime imaging microscopy of metabolic coenzymes captures dynamic changes in the metabolic activity of macrophages while maintaining them in their endogenous microenvironment. This approach also resolves variations on a single-cell level, in contrast to bulk measurements provided by traditional biochemical assays, making it a potentially valuable tool in the field of immunometabolism.