In methanogenic archaea growing on H 2 and CO 2 the first step in methanogenesis is the ferredoxin-dependent endergonic reduction of CO 2 with H 2 to formylmethanofuran and the last step is the exergonic reduction of the heterodisulfide CoM-S-S-CoB with H 2 to coenzyme M (CoM-SH) and coenzyme B (CoB-SH). We recently proposed that in hydrogenotrophic methanogens the two reactions are energetically coupled via the cytoplasmic MvhADG/HdrABC complex. It is reported here that the purified complex from Methanothermobacter marburgensis catalyzes the CoM-S-S-CoB-dependent reduction of ferredoxin with H 2 . Per mole CoM-S-S-CoB added, 1 mol of ferredoxin (Fd) was reduced, indicating an electron bifurcation coupling mechanism: This stoichiometry of coupling is consistent with an ATP gain per mole methane from 4 H 2 and CO 2 of near 0.5 deduced from an H 2 -threshold concentration of 8 Pa and a growth yield of up to 3 g/mol methane.

We determined the structure of a complete, dimeric F1Fo-ATP synthase from yeast Yarrowia lipolytica mitochondria by a combination of cryo-EM and X-ray crystallography. The final structure resolves 58 of the 60 dimer subunits. Horizontal helices of subunit a in Fo wrap around the c-ring rotor, and a total of six vertical helices assigned to subunits a, b, f, i, and 8 span the membrane. Subunit 8 (A6L in human) is an evolutionary derivative of the bacterial b subunit. On the lumenal membrane surface, subunit f establishes direct contact between the two monomers. Comparison with a cryo-EM map of the F1Fo monomer identifies subunits e and g at the lateral dimer interface. They do not form dimer contacts but enable dimer formation by inducing a strong membrane curvature of ∼100°. Our structure explains the structural basis of cristae formation in mitochondria, a landmark signature of eukaryotic cell morphology.

Sphingolipid levels are crucial determinants of neurodegenerative disorders and therefore require tight regulation. The Orm protein family and ceramides inhibit the rate-limiting step of sphingolipid biosynthesis-the condensation of L-serine and palmitoyl-coenzyme A (CoA). The yeast isoforms Orm1 and Orm2 form a complex with the serine palmitoyltransferase (SPT). While Orm1 and Orm2 have highly similar sequences, they are differentially regulated, though the mechanistic details remain elusive. Here, we determine the cryoelectron microscopy structure of the SPT complex containing Orm2. Complementary in vitro activity assays and genetic experiments with targeted lipidomics demonstrate a lower activity of the SPT-Orm2 complex than the SPT-Orm1 complex. Our results suggest a higher inhibitory potential of Orm2, despite the similar structures of the Orm1- and Orm2-containing complexes. The high conservation of SPT from yeast to man implies different regulatory capacities for the three human ORMDL isoforms, which might be key for understanding their role in sphingolipid-mediated neurodegenerative disorders.

Summary The levels of sphingolipids are crucial determinants of neurodegenerative disorders. Therefore, sphingolipid levels have to be tightly regulated. The Orm protein family and ceramides act as inhibitors in the rate-limiting step of sphingolipid biosynthesis – the condensation of L-serine and palmitoyl-CoA. The two yeast isoforms Orm1 and Orm2 form a complex with the serine palmitoyltransferase (SPT). While the sequences of the Orm proteins are highly similar, however, Orm1 and Orm2 are differentially regulated in yeast cells. The mechanistic details of the differential regulation remain elusive. To elucidate the regulatory mechanism, we determined the cryo-electron microscopy structure of the SPT complex containing Orm2. Through in vitro activity assays and a newly developed plasmid coverage assay combined with targeted lipidomics, we demonstrate that the SPT complex with Orm2 exhibits lower activity in comparison to the complex containing Orm1. This collectively suggests a higher inhibitory potential of Orm2, despite the remarkably similar structures of the Orm1- and Orm2 containing complexes. The high conservation of the SPT from yeast to man implies that the three human ORMDL isoforms could also have different regulatory capacities, which might be essential to understanding their role in sphingolipid-mediated neurodegenerative disorders. Highlights Cryo-EM structures of serine palmitoyltransferase with Orm2 from S. cerevisiae Ceramide-mediated inhibition on SPT activity is conserved amongst SPTs The two yeast Orm isoforms have different regulatory capacity

Summary Mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) is a 1 MDa membrane protein complex with a central role in energy metabolism. Redox-driven proton translocation by complex I contributes substantially to the proton motive force that drives ATP synthase. Several structures of complex I from bacteria and mitochondria have been determined but its catalytic mechanism has remained controversial. We here present the cryo-EM structure of complex I from Yarrowia lipolytica at 2.1 Å resolution, which reveals the positions of more than 1600 protein-bound water molecules, of which ∼100 are located in putative proton translocation pathways. Another structure of the same complex under steady-state activity conditions at 3.4 Å resolution indicates conformational transitions that we associate with proton injection into the central hydrophilic axis. By combining high-resolution structural data with site-directed mutagenesis and large-scale molecular dynamics simulations, we define details of the proton translocation pathways, and offer new insights into the redox-coupled proton pumping mechanism of complex I.

High-resolution structure determination of membrane proteins typically requires isolation from the native lipid bilayer and reconstitution into artificial membrane mimics. For this purpose, numerous detergents, amphipols, polymers and membrane scaffold proteins are available. The choice of the specific membrane substitute can strongly affect the protein's specific activity, stability and conformational spectrum, potentially leading to errors or misinterpretation during analysis. The bacterial ATP-binding cassette transporter MsbA is a prominent example of such environment-specific bias, resulting in apparent conformational and activity responses. Here, we present a systematic analysis of the conformational spectrum of MsbA, stabilized in a dozen environments, using cryo-EM. Our data show pronounced structural feedback of the ABC transporter to the respective membrane mimetics. Detergents generally favour a conformation with wide separation of the nucleotide-binding domains, while nanodiscs induce the narrow conformation. Notably, only three of the dozen tested environments allow MsbA to sample the functional conformational spectrum, enabling full movement of the nucleotide-binding domains between narrow and wide inward-facing conformations. We expect this study to serve as a blueprint for other membrane proteins, even where the structural reaction to the hydrophobic environment is not directly visible but still critical for the proteins' function.

Abstract P-glycoprotein (Pgp) is a prototypical ABC transporter of great biological and clinical significance that confers cancer multidrug resistance and mediates the bioavailability and pharmacokinetics of many drugs 1–3 . Decades of structural and biochemical studies have provided insights into how Pgp binds diverse compounds 4–9 , but how they are translocated through the membrane has remained elusive. Here, we covalently attached a cyclic substrate to discrete sites of Pgp and determined multiple complex structures in inward- and outward-facing states by cryoEM. In conjunction with molecular dynamics simulations, our structures trace the substrate passage across the membrane and identify conformational changes in transmembrane helix 1 (TM1) as regulators of substrate transport. In mid-transport conformations, TM1 breaks at glycine 72. Mutation of this residue significantly impairs drug transport of Pgp in vivo, corroborating the importance of its regulatory role. Importantly, our data suggest that the cyclic substrate can exit Pgp without the requirement of a wide-open outward-facing conformation, diverting from the common efflux model for Pgp and other ABC exporters. The substrate transport mechanism of Pgp revealed here pinpoints critical targets for future drug discovery studies of this medically relevant system.

Abstract Sphingolipids are structural membrane components that also function in cellular stress responses. The serine palmitoyl-transferase (SPT) catalyzes the rate limiting step in sphingolipid biogenesis. Its activity is tightly regulated through multiple binding partners, including Tsc3, Orm proteins, ceramides, and the phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) phosphatase Sac1. The structural organization and regulatory mechanisms of this complex are not yet understood. Here, we report the high-resolution cryo-EM structures of the yeast SPT in complex with Tsc3 and Orm1 (SPOT) as dimers and monomers and a monomeric complex further carrying Sac1 (SPOTS). In all complexes, the tight interaction of the downstream metabolite ceramide and Orm1 reveals the ceramide dependent inhibition. Additionally, observation of ceramide and ergosterol binding suggests a co-regulation of sphingolipid biogenesis and sterol metabolism within the SPOTS complex.

Abstract Here we describe the cryo-electron microscopy structure of the human histamine 2 receptor (H 2 R) in an active conformation with bound histamine and in complex with G s heterotrimeric protein at an overall resolution of 3.4 Å. The complex was generated by cotranslational insertion into preformed nanodisc membranes using cell-free synthesis in E. coli lysates. It is the first structure obtained by this detergent-free strategy and the first GPCR/G s complex structure in lipid environment. Structural comparison with the inactive conformation of H 2 R and the inactive and G q -coupled active state of H 1 R together with structure-guided functional experiments reveal molecular insights into the specificity of ligand binding and G protein coupling for this receptor family. We demonstrate lipid-modulated folding of cell-free synthesized H 2 R, its agonist-dependent internalization and its interaction with endogenously synthesized H 1 R and H 2 R in HEK293 cells by applying a recently developed nanotransfer technique.