The discovery of two genes encoded by prophage WO from Wolbachia that functionally recapitulate and enhance cytoplasmic incompatibility in arthropods is the first inroad in solving the genetic basis of reproductive parasitism. Bacteria from the genus Wolbachia infect many arthropods, including the mosquitoes that are vectors for many viruses that infect humans. Wolbachia infection causes 'cytoplasmic incompatibility', which means that crosses between infected males and uninfected females lead to embryonic death, increasing the proportion of infected females in the population. The molecular basis for this effect has been unknown. Here, Seth Bordenstein and colleagues use comparative and transgenic approaches to identify two genes encoded by the prophage WO from Wolbachia that recapitulate cytoplasmic incompatibility. The discovery of these cytoplasmic incompatibility factors could lead to the genetic manipulation of WO-induced reproductive alterations, and may feed into efforts to control the transmission of arthropod-borne viruses to humans. The genus Wolbachia is an archetype of maternally inherited intracellular bacteria that infect the germline of numerous invertebrate species worldwide. They can selfishly alter arthropod sex ratios and reproductive strategies to increase the proportion of the infected matriline in the population. The most common reproductive manipulation is cytoplasmic incompatibility, which results in embryonic lethality in crosses between infected males and uninfected females. Females infected with the same Wolbachia strain rescue this lethality. Despite more than 40 years of research1 and relevance to symbiont-induced speciation2,3, as well as control of arbovirus vectors4,5,6 and agricultural pests7, the bacterial genes underlying cytoplasmic incompatibility remain unknown. Here we use comparative and transgenic approaches to demonstrate that two differentially transcribed, co-diverging genes in the eukaryotic association module of prophage WO8 from Wolbachia strain wMel recapitulate and enhance cytoplasmic incompatibility. Dual expression in transgenic, uninfected males of Drosophila melanogaster crossed to uninfected females causes embryonic lethality. Each gene additively augments embryonic lethality in crosses between infected males and uninfected females. Lethality associates with embryonic defects that parallel those of wild-type cytoplasmic incompatibility and is notably rescued by wMel-infected embryos in all cases. The discovery of cytoplasmic incompatibility factor genes cifA and cifB pioneers genetic studies of prophage WO-induced reproductive manipulations and informs the continuing use of Wolbachia to control dengue and Zika virus transmission to humans.

Wolbachia are obligate intracellular bacteria1 that infect arthropods, including approximately two-thirds of insect species2. Wolbachia manipulate insect reproduction by enhancing their inheritance through the female germline. The most common alteration is cytoplasmic incompatibility (CI)3-5, where eggs from uninfected females fail to develop when fertilized by sperm from Wolbachia-infected males. By contrast, if female and male partners are both infected, embryos are viable. CI is a gene-drive mechanism impacting population structure6 and causing reproductive isolation7, but its molecular mechanism has remained unknown. We show that a Wolbachia deubiquitylating enzyme (DUB) induces CI. The CI-inducing DUB, CidB, cleaves ubiquitin from substrates and is encoded in a two-gene operon, and the other protein, CidA, binds CidB. Binding is strongest between cognate partners in cidA-cidB homologues. In transgenic Drosophila, the cidA-cidB operon mimics CI when sperm introduce it into eggs, and a catalytically inactive DUB does not induce sterility. Toxicity is recapitulated in yeast by CidB alone; this requires DUB activity but is rescued by coexpressed CidA. A paralogous operon involves a putative nuclease (CinB) rather than a DUB. Analogous binding, toxicity and rescue in yeast were observed. These results identify a CI mechanism involving interacting proteins that are secreted into germline cells by Wolbachia, and suggest new methods for insect control.

Abstract Wolbachiae are obligate intracellular bacteria that infect arthropods and certain nematodes. Usually maternally inherited, they may provision nutrients to (mutualism) or alter sexual biology of (reproductive parasitism) their invertebrate hosts. We report the assembly of closed genomes for two novel wolbachiae, w CfeT and w CfeJ, found co-infecting cat fleas ( Ctenocephalides felis ) of the Elward Laboratory colony (Soquel, CA). w CfeT is basal to nearly all described Wolbachia supergroups, while w CfeJ is related to supergroups C, D and F. Both genomes contain laterally transferred genes that inform on the evolution of Wolbachia host associations. w CfeT carries the Biotin synthesis Operon of Obligate intracellular Microbes (BOOM); our analyses reveal five independent acquisitions of BOOM across the Wolbachia tree, indicating parallel evolution towards mutualism. Alternately, w CfeJ harbors a toxin-antidote operon analogous to the w Pip cinAB operon recently characterized as an inducer of cytoplasmic incompatibility (CI) in flies. w CfeJ cinB and immediate-5’ end genes are syntenic to large modular toxins encoded in CI-like operons of certain Wolbachia strains and Rickettsia species, signifying that CI toxins streamline by fission of larger toxins. Remarkably, the C . felis genome itself contains two CI-like antidote genes, divergent from wCfeJ cinA , revealing episodic reproductive parasitism in cat fleas and evidencing mobility of CI loci independent of WO-phage. Additional screening revealed predominant co-infection ( w CfeT/ w CfeJ) amongst C . felis colonies, though occasionally w CfeJ singly infects fleas in wild populations. Collectively, genomes of w CfeT, w CfeJ, and their cat flea host supply instances of lateral gene transfers that could drive transitions between parasitism and mutualism. Importance Many arthropod and certain nematode species are infected with wolbachiae which are intracellular bacteria well known for reproductive parasitism (RP). Like other RP strategies, Wolbachia -induced cytoplasmic incompatibility, CI, increases prevalence and frequency in host populations. Mutualism is another strategy employed by wolbachiae to maintain host infection, with some strains synthesizing and supplementing certain B vitamins (particularly biotin) to invertebrate hosts. Curiously, we discovered two novel Wolbachia strains that co-infect cat fleas ( Ctenocephalides felis ): w CfeT carries biotin synthesis genes, while w CfeJ carries a CI-inducing toxin-antidote operon. Our analyses of these genes highlight their mobility across the Wolbachia phylogeny and source to other intracellular bacteria. Remarkably, the C . felis genome also carries two CI-like antidote genes divergent from the w CfeJ antidote gene, indicating episodic RP in cat fleas. Collectively, w CfeT and w CfeJ inform on the rampant dissemination of diverse factors that mediate Wolbachia strategies for persisting in invertebrate host populations.

Mosquitoes and other biting arthropods transmit diseases worldwide, causing over 700,000 deaths each year, and costing about 3 billion USD annually for Aedes species alone. Insect vectored diseases also pose a considerable threat to agricultural animals. While clothing could provide a simple solution to vector-borne diseases, modern textiles do not effectively block mosquito bites. Here we have designed three micro-resolution knitted structures, with five adjustable parameters that can block mosquito bites. These designs, which exhibit significant bite reduction were integrated into a computer numerical control knitting robot for mass production of bite-blocking garments with minimal human labor. We then quantified the comfort of blocking garments. Our knits enable individuals to protect themselves from insects amidst their day-to-day activities without impacting the environment. Bryan Holt, Kyle Oswalt and colleagues design the mosquito bite-proof knitting pattern. Their approach can be implemented in programmable knitting robots for mass production.

Recent metagenome assembled genome (MAG) analyses have profoundly impacted Rickettsiology systematics. Discovery of basal lineages (Mitibacteraceae and Athabascaceae) with predicted extracellular lifestyles reveals an evolutionary timepoint for the transition to host dependency, which occurred independent of mitochondrial evolution. Notably, these basal rickettsiae carry the Rickettsiales vir homolog (rvh) type IV secretion system (T4SS) and purportedly use rvh to kill congener microbes rather than parasitize host cells as described for derived rickettsial pathogens. MAG analysis also substantially increased diversity for genus Rickettsia and delineated a basal lineage (Tisiphia) that stands to inform on the rise of human pathogens from protist and invertebrate endosymbionts. Herein, we probed Rickettsiales MAG and genomic diversity for the distribution of Rickettsia rvh effectors to ascertain their origins. A sparse distribution of most Rickettsia rvh effectors outside of Rickettsiaceae lineages indicates unique rvh evolution from basal extracellular species and other rickettsial families. Remarkably, nearly every effector was found in multiple divergent forms with variable architectures, illuminating profound roles for gene duplication and recombination in shaping effector repertoires in Rickettsia pathogens. Lateral gene transfer plays a prominent role shaping the rvh effector landscape, as evinced by the discover of many effectors on plasmids and conjugative transposons, as well as pervasive effector gene exchange between Rickettsia and Legionella species. Our study exemplifies how MAGs can provide incredible insight on the origins of pathogen effectors and how their architectural modifications become tailored to eukaryotic host cell biology.

Abstract Evolutionary algorithms (EAs) simulate Darwinian evolution and adeptly mimic natural evolution. Most EA applications in biology encode high levels of abstraction in top-down ecological population models. In contrast, our research merges protein alignment algorithms from bioinformatics into codon based EAs that simulate molecular protein string evolution from the bottom up. We apply our EA to reconcile a problem in the field of Wolbachia induced cytoplasmic incompatibility (CI). Wolbachia is a microbial endosymbiont that lives inside insect cells. CI is conditional insect sterility that operates as a toxin antidote (TA) system. Although, CI exhibits complex phenotypes not fully explained under a single discrete model. We instantiate in-silico genes that control CI, CI factors ( cifs ), as strings within the EA chromosome. We monitor the evolution of their enzymatic activity, binding, and cellular localization by applying selective pressure on their primary amino acid strings. Our model helps rationalize why two distinct mechanisms of CI induction might coexist in nature. We find that nuclear localization signals (NLS) and Type IV secretion system signals (T4SS) are of low complexity and evolve fast, whereas binding interactions have intermediate complexity, and enzymatic activity is the most complex. Our model predicts that as ancestral TA systems evolve into eukaryotic CI systems, the placement of NLS or T4SS signals can stochastically vary, imparting effects that might impact CI induction mechanics. Our model highlights how preconditions, genetic diversity, and sequence length can bias evolution of cifs towards one mechanism or another.

Abstract Mosquitoes and other biting arthropods transmit diseases worldwide, causing over 700,000 deaths each year, and costing about 3 billion annually for Aedes species alone. These insects also pose a significant threat to agricultural animals. While clothing could provide a simple solution to vector-borne diseases, modern textiles do not effectively block mosquito bites. To address this issue, we have designed three micro-resolution knitted structures, with five adjustable parameters, that can block bites. These designs were integrated into a computer numerical control knitting robot for mass production of bite-blocking garments with minimal human labor. We then quantified the comfort of blocking garments. Our knits enable individuals to protect themselves from insects amidst their day-to-day activities without impacting the environment. One Sentence Summary We create micro-resolution mosquito bite blocking knits produced by robotic manufacturing to protect humans against vector-borne disease.