Abstract During the human papillomavirus 16 (HPV16) life cycle, the E2 protein interacts with host factors to regulate viral transcription, replication and genome segregation/retention. Our understanding of host partner proteins and their roles in E2 functions remains incomplete. Here, we demonstrate that CK2 phosphorylation of E2 on serine 23 promotes interaction with TopBP1 in vitro and in vivo , and that E2 is phosphorylated on this residue during the HPV16 life cycle. We investigated the consequences of mutating serine 23 on E2 functions. E2-S23A activates and represses transcription identically to E2-WT (wild-type), and E2-S23A is as efficient as E2-WT in transient replication assays. However, E2-S23A has compromised interaction with mitotic chromatin when compared with E2-WT. In E2-WT cells, both E2 and TopBP1 levels increase during mitosis when compared with vector control cells. In E2-S23A cells, neither E2 nor TopBP1 levels increase during mitosis. We next tested whether this difference in E2-S23A levels during mitosis disrupts E2 plasmid retention function. We developed a novel plasmid retention assay and demonstrate that E2-S23A is deficient in plasmid retention when compared with E2-WT. siRNA targeted knockdown of TopBP1 abrogates E2-WT plasmid retention function. Introduction of the S23A mutation into the HPV16 genome resulted in delayed immortalization of human foreskin keratinocytes (HFK) and higher episomal viral genome copy number in resulting established HFK. Overall, our results demonstrate that CK2 phosphorylation of E2 on serine 23 promotes interaction with TopBP1, which is critical for E2 plasmid retention function and in HPV16 immortalization of keratinocytes. Importance Human papillomaviruses are causative agents in around 5% of all cancers, with no specific anti-viral therapeutics available for treating infections or resultant cancers. In this report, we demonstrate that phosphorylation of HPV16 E2 by CK2 promotes formation of a complex formation with the cellular protein TopBP1 in vitro and in vivo . This complex results in stabilization of E2 during mitosis and mediates plasmid retention by E2. This function promotes the partitioning of viral genomes into the nuclei of daughter cells following mitosis. We demonstrate that CK2 phosphorylates E2 on serine 23 in vivo , and that CK2 inhibitors disrupt the E2-TopBP1 complex. Mutation of E2 serine 23 to alanine disrupts the HPV16 life cycle, demonstrating a critical function for this residue. Together, our results suggest that CK2 inhibitors may disrupt the E2-TopBP1 dependent HPV16 life cycle and potentially kill HPV16 positive cancers, which lays a molecular foundation to develop novel therapeutic approaches for combating HPV16 disease.

Activation of the replicative Mcm2-7 helicase by loading GINS and Cdc45 is crucial for replication origin firing, and as such for faithful genetic inheritance. Our biochemical and structural studies demonstrate that the helicase activator GINS interacts with TopBP1 through two separate binding surfaces, the first involving a stretch of highly conserved amino acids in the TopBP1-GINI region, the second a surface on TopBP1-BRCT4. The two surfaces bind to opposite ends of the A domain of the GINS subunit Psf1. Mutation analysis revealed that either surface is able to support TopBP1-GINS interaction, albeit with reduced affinity. Consistently, either surface is sufficient for replication origin firing in Xenopus egg extracts and becomes essential in the absence of the other. The TopBP1-GINS interaction appears sterically incompatible with simultaneous binding of DNA polymerase epsilon (Pole) to GINS when bound to Mcm2-7-Cdc45, although TopBP1-BRCT4 and the Pole subunit PolE2 bind to largely distinct neighbouring sites in Psf1. Our TopBP1-GINS model improves our understanding of the recently characterised metazoan pre-loading complex. It further predicts the coordination of three molecular origin firing processes, DNA polymerase epsilon arrival, TopBP1 ejection and GINS integration into Mcm2-7-Cdc45.

ABSTRACT BLM (Bloom syndrome protein) is a RECQ-family helicase involved in the dissolution of complex DNA structures and repair intermediates. Synthetic lethality analysis implicates BLM as a promising target in a range of cancers with defects in the DNA damage response, however selective small molecule inhibitors of defined mechanism are currently lacking. Here we identify and characterise a specific inhibitor of BLM’s ATPase-coupled DNA helicase activity, by allosteric trapping of a DNA-bound translocation intermediate. Crystallographic structures of BLM-DNA-ADP-inhibitor complexes identify a hitherto unknown interdomain interface, whose opening and closing are integral to translocation of ssDNA, and which provides a highly selective pocket for drug discovery. Comparison with structures of other RECQ helicases provides a model for branch migration of Holliday junctions by BLM.