Abstract Recent advances in single cell RNA sequencing allow users to pool multiple samples and demultiplex in downstream analysis, which greatly increase experimental efficiency and cost-effectiveness. Among all the demultiplexing methods, nucleotide barcode-based cell hashing has gained widespread popularity due to its compatibility and simplicity. Despite these advantages, certain issues of this technic remain to be solved, such as challenges in distinguishing true positive from background, high reagent cost for samples with large cell numbers, and unpredictable false negative and false doublet rates. Here, we propose a hybrid demultiplexing strategy that increases calling accuracy and cell recovery of cell hashing without adding experimental cost. In this approach, we computationally cluster all single cells based on their natural genetic variations and assign donor identity by finding the dominant hashtag in each genotype cluster. This hybrid strategy assigns donor identity to any cell that is identified as singlet by either genotype clustering or cell hashing, which allows us to demultiplex most majority of cells even if only a small fraction of cells are labeled with hashtags. When comparing its performance with cell hashing on multiple real-world datasets, this hybrid approach consistently generates reliable demultiplexing results with increased cell recovery and accuracy. Key Points The improved cut-off calling tool, HTOreader, accurately distinguishes true positive from background signal for each individual hashtag. The hybrid demultiplexing strategy increases cell recovery of cell hashing by increasing cut-off calling accuracy and decreasing false negative and false double rates. The hybrid strategy enhances cost-effectiveness of cell hashing and consistently produces reliable demultiplexing results, regardless of hashtag staining quality. The hybrid strategy can be seamlessly integrated into a variety of single-cell experimental protocols and analytic pipelines.

Abstract Influenza viruses grown in eggs for the purposes of vaccine generation often acquire mutations during egg adaptation or possess differential glycosylation patterns than viruses circulating amongst humans. Here, we report that seasonal influenza virus vaccines possess an egg-derived sulfated N-acetyllactosamine (LacNAc) that is an antigenic decoy. Half of subjects that received an egg-grown vaccine mounted an antibody response against this egg-derived antigen. Egg-binding monoclonal antibodies specifically bind viruses grown in eggs, but not viruses grown in other chicken derived cells, suggesting only egg-grown vaccines can induce anti-LacNAc antibodies. Notably, antibodies against the sulfated LacNAc utilized a restricted antibody repertoire and possessed features of natural antibodies, as most antibodies were IgM and have simple heavy chain complementarity determining region 3. By analyzing a public dataset of influenza virus vaccine induced plasmablasts, we discovered egg-binding public clonotypes that were shared across studies. Together, this study shows that egg-grown vaccines can induce antibodies against an egg-associated glycan, which may divert the host immune response away from protective epitopes.

Abstract Wild aquatic birds maintain a large genetically diverse pool of influenza A viruses (IAVs), which can be transmitted to lower mammals and ultimately humans. Through phenotypic analyses, only a small set of avian IAVs replicated well in the epithelial cells of swine upper respiratory tracts, and these viruses were shown to infect and cause virus shedding in pigs. Such a phenotypic trait appears to emerge randomly and are distributed among IAVs across multiple avian species, geographic and temporal orders, and is determined not by receptor binding preference but other markers across genomic segments, such as those in the ribonucleoprotein complex. This study demonstrates that phenotypic variants exist among avian IAVs, only a few of which may result in viral shedding in pigs upon infection, providing opportunities for these viruses to become pig adapted, thus posing a higher potential risk for creating novel variants or detrimental reassortants within pig populations. Author Summary Having both avian-like receptors and human-like α2,6-linked sialic acid receptors, swine serve as a “mixing vessel” for generating human influenza pandemic strains. All HA subtypes of IAVs can infect swine; however, only sporadic cases of avian IAVs are reported in domestic swine. The molecular mechanisms affecting avian IAVs ability to infect swine are still not fully understood. Through phenotypic analyses, this study suggested that tissue tropisms (i.e., in swine upper respiratory tracts) of avian IAVs affect their spillovers from wild birds to pigs, and this phenotype was determined not by receptor binding preference but by other markers across genomic segments, such as those in the ribonucleoprotein complex. In addition, our results showed that such a phenotypic trait was sporadically and randomly distributed among IAVs across multiple avian species, geographic and temporal orders. This study suggested an efficient way for risk assessment of avian IAVs, such as in evaluating their potentials to be transmitted from avian to pigs.

Abstract Artificial mutagenesis and chimeric/mosaic protein engineering have laid the foundation for antigenic characterization 1 and universal vaccine design 2–4 for influenza viruses. However, many methods used for influenza research and vaccine development require sequence editing and protein expression, limiting their applicability and the progress of related research to specialists. Rapid tools allowing even novice influenza researchers to properly analyze and visualize influenza protein sequences with accurate nomenclature are needed to expand the research field. To address this need, we developed Librator, a system for analyzing and designing protein sequences of influenza virus Hemagglutinin (HA) and Neuraminidase (NA). With Librator’s graphical user interface (GUI) and built-in sequence editing functions, biologists can easily analyze influenza sequences and phylogenies, automatically port sequences to visualize structures, then readily mutate target residues and design sequences for antigen probes and chimeric/mosaic proteins efficiently and accurately. This system provides optimized fragment design for Gibson Assembly 5 of HA and NA expression constructs based on peptide conservation of all historical HA and NA sequences, ensuring fragments are reusable and compatible, allowing for significant reagent savings. Use of Librator will significantly facilitate influenza research and vaccine antigen design.

Abstract Migratory waterfowl, gulls, and shorebirds serve as natural reservoirs for influenza A viruses, with potential spillovers to domestic poultry and humans. The intricacies of interspecies adaptation among avian species, particularly from wild birds to domestic poultry, are not fully elucidated. In this study, we investigated the molecular mechanisms underlying avian species barriers in H7 transmission, particularly the factors responsible for the disproportionate distribution of poultry infected with A/Anhui/1/2013 (AH/13)-lineage H7N9 viruses. We hypothesized that the differential expression of N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) among avian species exerts selective pressure on H7 viruses, shaping their evolution and enabling them to replicate and transmit efficiently among gallinaceous poultry, particularly chickens. Our glycan microarray and biolayer interferometry experiments showed that AH/13-lineage H7N9 viruses exclusively bind to Neu5Ac, in contrast to wild waterbird H7 viruses that bind both Neu5Ac and Neu5Gc. Significantly, reverting the V179 amino acid in AH/13-lineage back to the I179, predominantly found in wild waterbirds, expanded the binding affinity of AH/13-lineage H7 viruses from exclusively Neu5Ac to both Neu5Ac and Neu5Gc. When cultivating H7 viruses in cell lines with varied Neu5Gc levels, we observed that Neu5Gc expression impairs the replication of Neu5Ac-specific H7 viruses and facilitates adaptive mutations. Conversely, Neu5Gc deficiency triggers adaptive changes in H7 viruses capable of binding to both Neu5Ac and Neu5Gc. Additionally, we assessed Neu5Gc expression in the respiratory and gastrointestinal tissues of seven avian species, including chickens, Canada geese, and various dabbling ducks. Neu5Gc was absent in chicken and Canada goose, but its expression varied in the duck species. In summary, our findings reveal the crucial role of Neu5Gc in shaping the host range and interspecies transmission of H7 viruses. This understanding of virus-host interactions is crucial for developing strategies to manage and prevent influenza virus outbreaks in diverse avian populations. Author Summary Migratory waterfowl, gulls, and shorebirds are natural reservoirs for influenza A viruses that can occasionally spill over to domestic poultry, and ultimately humans. The molecular mechanisms underlying interspecies transmission and adaptation, particularly between wild birds and domestic poultry, remain poorly understood. This study showed wild-type H7 influenza A viruses from waterbirds initially bind to glycan receptors terminated with N-Acetylneuraminic acid (Neu5Ac) or N-Glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). However, after enzootic transmission in chickens, the viruses exclusively bind to Neu5Ac. The absence of Neu5Gc expression in gallinaceous poultry, particularly chickens, exerts selective pressure, shaping influenza virus populations, and promoting the acquisition of adaptive amino acid substitutions in the hemagglutinin protein of H7 influenza A viruses. This results in the loss of Neu5Gc binding and an increase in virus transmissibility in gallinaceous poultry, particularly chickens. Consequently, the transmission capability of these poultry-adapted H7 viruses in wild water birds decreases. Timely intervention, such as stamping out, may help reduce virus adaptation to domestic chicken populations and lower the risk of enzootic outbreaks, including those caused by influenza A viruses exhibiting high pathogenicity.

Abstract Viral tracers that permit efficient retrograde targeting of projection neurons are powerful vehicles for structural and functional dissections of the neural circuit and for the treatment of brain diseases. Recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) are the most potential candidates because they are low-toxic with high-level transgene expression and minimal host immune responses. Currently, some rAAVs based on capsid engineering for retrograde tracing have been widely used in the analysis and manipulation of neural circuits, but suffer from brain area selectivity and inefficient retrograde transduction in certain neural connections. Here, we discovered that the recombinant adeno-associated virus 11 (rAAV11) exhibits potent retrograde labeling of projection neurons with enhanced efficiency to rAAV2-retro in some neural connections. Combined with calcium recording technology, rAAV11 can be used to monitor neuronal activities by expressing Cre recombinase or calcium-sensitive functional probe. In addition, we further showed the suitability of rAAV11 for astrocyte targeting. These properties make rAAV11 a promising tool for the mapping and manipulation of neural circuits and gene therapy of some neurological and neurodegenerative disorders. Highlights Naturally occurring AAV serotype capsid exhibits robust retrograde functionality Improved distribution properties and retrograde transport efficiency Can express Cre recombinase or calcium-sensitive functional probe for neural circuits monitoring Can specifically target astrocytes