Abstract The σ 2 receptor is a poorly understood transmembrane receptor that has attracted intense interest in many areas of biology including cancer imaging, Alzheimer’s disease, schizophrenia, and neuropathic pain. However, little is known regarding the molecular details of the receptor, and few highly selective ligands are available. Here, we report the crystal structure of the σ 2 receptor in complex with the clinical drug candidate roluperidone and the probe compound PB28. These structures, in turn, templated a large-scale docking screen of 490 million make-on-demand molecules. Of these, 484 compounds were synthesized and tested, prioritizing not only high-ranking docked molecules, but also those with mediocre and poor scores. Overall, 127 compounds with binding affinities superior to 1 μM were identified, all in new chemotypes, 31 of which had affinities superior to 50 nM. Intriguingly, hit rate fell smoothly and monotonically with docking score. Seeking to develop selective and biologically active probe molecules, we optimized three of the original docking hits for potency and for selectivity, achieving affinities in the 3 to 48 nM range and to up to 250-fold selectivity vs. the σ 1 receptor. Crystal structures of the newly discovered ligands bound to the σ 2 receptor were subsequently determined, confirming the docked poses. To investigate the contribution of the σ 2 receptor in pain processing, and to distinguish it from the contribution of the σ 1 receptor, two potent σ 2 -selective and one potent σ 1 /σ 2 non-selective ligand were tested for efficacy in a mouse model of neuropathic pain. All three ligands demonstrated timedependent decreases in mechanical hypersensitivity in the spared nerve injury model, supporting a role for the σ 2 receptor in nociception, and a possible role for σ 1 /σ 2 polypharmacology. This study illustrates the opportunities for rapid discovery of in vivo active and selective probes to study under-explored areas of biology using structurebased screens of diverse, ultra-large libraries following the elucidation of protein structures.

ABSTRACT Recent evidence suggests that psychedelic drugs can exert beneficial effects on anxiety, depression, and ethanol and nicotine abuse in humans. However, the hallucinogenic side-effects of psychedelics often preclude their clinical use. Lysergic acid diethylamide (LSD) is a prototypical hallucinogen and its psychedelic actions are exerted through the 5-HT 2A serotonin receptor (5-HT2AR). 5-HT2AR activation stimulates Gq- and β-arrestin-(βArr) mediated signaling. To separate effects of these signaling modes, we have used βArr1 and βArr2 mice. We find that LSD stimulates motor activities to similar extents in WT and βArr1-KO mice, with non-significant effects in βArr2-KOs. LSD robustly stimulates many surrogates of psychedelic drug actions including head twitches, grooming, retrograde walking, and nose poking in WT and βArr1-KO animals. In contrast, LSD only slightly stimulates head twitches in βArr2-KO mice, without effects on retrograde walking or nose poking. The 5-HT2AR antagonist MDL100907 (MDL) blocks these LSD effects. LSD also disrupts prepulse inhibition (PPI) in WT and βArr1-KOs; PPI is unaffected in βArr2-KOs. MDL restores PPI in WT mice, but this antagonist is without effect and haloperidol is required in βArr1-KOs. LSD produces a biphasic body-temperature response in WT mice, a monophasic response in βArr1-KOs, and is without effect in βArr2 mutants. Both MDL and the 5-HT1AR antagonist, WAY 100635 (WAY), block the effects of LSD on body temperatures in WT mice, whereas WAY is effective in βArr1-KOs. Collectively, these results reveal that LSD produces diverse behavioral effects through βArr1 and βArr2, and that LSD’s psychedelic drug-like actions appear to require βArr2.

Proximity labeling (PL) coupled with mass spectrometry has emerged as a powerful technique to map proximal protein interactions in living cells. Large-scale sample processing for proximity proteomics necessitates a high-throughput workflow to reduce hands-on time and increase quantitative reproducibility. To address this issue, we developed a scalable and automated PL pipeline, including generation and characterization of monoclonal cell lines, automated enrichment of biotinylated proteins in a 96-well format, and optimization of the quantitative mass spectrometry (MS) acquisition method. Combined with data-independent acquisition (DIA) MS, our pipeline outperforms manual enrichment and data-dependent acquisition (DDA) MS regarding reproducibility of protein identification and quantification. We apply the pipeline to map subcellular proteomes for endosomes, late endosomes/lysosomes, the Golgi apparatus, and the plasma membrane. Moreover, using serotonin receptor (5HT 2A ) as a model, we investigated agonist-induced dynamics in protein-protein interactions. Importantly, the approach presented here is universally applicable for PL proteomics using all biotinylation-based PL enzymes, increasing both throughput and reproducibility of standard protocols.

Since it was proposed as a potential host-directed antiviral agent for SARS-CoV-2, the antiparasitic drug ivermectin has been investigated thoroughly in clinical trials, which have provided insufficient support for its clinical efficacy. To examine the potential for ivermectin to be repurposed as an antiviral agent, we therefore undertook a series of preclinical studies. Consistent with early reports, ivermectin decreased SARS-CoV-2 viral burden in in vitro models at low micromolar concentrations, five- to ten-fold higher than the reported toxic clinical concentration. At similar concentrations, ivermectin also decreased cell viability and increased biomarkers of cytotoxicity and apoptosis. Further mechanistic and profiling studies revealed that ivermectin nonspecifically perturbs membrane bilayers at the same concentrations where it decreases the SARS-CoV-2 viral burden, resulting in nonspecific modulation of membrane-based targets such as G-protein coupled receptors and ion channels. These results suggest that a primary molecular mechanism for the in vitro antiviral activity of ivermectin may be nonspecific membrane perturbation, indicating that ivermectin is unlikely to be translatable into a safe and effective antiviral agent. These results and experimental workflow provide a useful paradigm for performing preclinical studies on (pandemic-related) drug repurposing candidates.

The assembly and specification of synapses in the brain is incompletely understood. Latrophilin-3, a postsynaptic adhesion-GPCR, mediates synapse formation in the hippocampus but the mechanisms involved remain unclear. Here we show that Latrophilin-3 organizes synapses by a novel dual-pathway mechanism: activation of GαS/cAMP-signaling and recruitment of phase-separated postsynaptic protein scaffolds. We found that cell type-specific alternative splicing of Latrophilin-3 controls its G protein coupling mode, resulting in Latrophilin-3 variants that predominantly signal via Gαs/cAMP or via Gα12/13. CRISPR-mediated manipulation of Latrophilin-3 alternative splicing from a GαS- to a Gα12/13-coupled mode impaired synaptic connectivity to a degree similar to the overall deletion of Latrophilin-3, suggesting that GαS/cAMP-signaling by Latrophilin-3 splice variants mediates synapse formation. Moreover, GαS- but not Gα12/13-coupled splice variants of Latrophilin-3 recruit phase-transitioned postsynaptic protein scaffolds that are clustered by binding of presynaptic Latrophilin-3 ligands. Strikingly, neuronal activity promotes alternative splicing of the synaptogenic variant of Latrophilin-3. Together, these data suggest that activity-dependent alternative splicing of a key synaptic adhesion molecule controls synapse formation by parallel activation of two convergent pathways: GαS/cAMP signaling and the phase separation of postsynaptic protein scaffolds.