Cellular diversity of the lung endothelium has not been systematically characterized in humans. We provide a reference atlas of human lung endothelial cells (ECs) to facilitate a better understanding of the phenotypic diversity and composition of cells comprising the lung endothelium.We reprocessed human control single-cell RNA sequencing (scRNAseq) data from 6 datasets. EC populations were characterized through iterative clustering with subsequent differential expression analysis. Marker genes were validated by fluorescent microscopy and in situ hybridization. scRNAseq of primary lung ECs cultured in vitro was performed. The signaling network between different lung cell types was studied. For cross-species analysis or disease relevance, we applied the same methods to scRNAseq data obtained from mouse lungs or from human lungs with pulmonary hypertension.Six lung scRNAseq datasets were reanalyzed and annotated to identify >15 000 vascular EC cells from 73 individuals. Differential expression analysis of EC revealed signatures corresponding to endothelial lineage, including panendothelial, panvascular, and subpopulation-specific marker gene sets. Beyond the broad cellular categories of lymphatic, capillary, arterial, and venous ECs, we found previously indistinguishable subpopulations; among venous EC, we identified 2 previously indistinguishable populations: pulmonary-venous ECs (COL15A1neg) localized to the lung parenchyma and systemic-venous ECs (COL15A1pos) localized to the airways and the visceral pleura; among capillary ECs, we confirmed their subclassification into recently discovered aerocytes characterized by EDNRB, SOSTDC1, and TBX2 and general capillary EC. We confirmed that all 6 endothelial cell types, including the systemic-venous ECs and aerocytes, are present in mice and identified endothelial marker genes conserved in humans and mice. Ligand-receptor connectome analysis revealed important homeostatic crosstalk of EC with other lung resident cell types. scRNAseq of commercially available primary lung ECs demonstrated a loss of their native lung phenotype in culture. scRNAseq revealed that endothelial diversity is maintained in pulmonary hypertension. Our article is accompanied by an online data mining tool (www.LungEndothelialCellAtlas.com).Our integrated analysis provides a comprehensive and well-crafted reference atlas of ECs in the normal lung and confirms and describes in detail previously unrecognized endothelial populations across a large number of humans and mice.

Abstract Background Despite its importance in health and disease, the cellular diversity of the lung endothelium has not been systematically characterized in humans. Here we provide a reference atlas of human lung endothelial cells (ECs), to facilitate a better understanding of the phenotypic diversity and composition of cells comprising the lung endothelium, both in health and disease. Methods We reprocessed control single cell RNA sequencing (scRNAseq) data from five datasets of whole lungs that were used for the analysis of pan-endothelial markers, we later included a sixth dataset of sorted control EC for the vascular subpopulation analysis. EC populations were characterized through iterative clustering with subsequent differential expression analysis. Marker genes were validated by immunohistochemistry and in situ hybridization. Signaling network between different lung cell types was studied using connectomic analysis. For cross species analysis we applied the same methods to scRNAseq data obtained from mouse lungs. Results The six lung scRNAseq datasets were reanalyzed and annotated to identify over 15,000 vascular EC cells from 73 individuals. Differential expression analysis of EC revealed signatures corresponding to endothelial lineage, including pan-endothelial, pan-vascular and subpopulation-specific marker gene sets. Beyond the broad cellular categories of lymphatic, capillary, arterial and venous ECs we found previously indistinguishable subpopulations; among venous EC we identified two previously indistinguishable populations, pulmonary-venous ECs (COL15A1 neg ) localized to the lung parenchyma and systemic-venous ECs (COL15A1 pos ) localized to the airways and the visceral pleura; among capillary EC we confirmed their subclassification into recently discovered aerocytes characterized by EDNRB, SOSTDC1 and TBX2 and general capillary EC. We confirmed that all six endothelial cell types, including the systemic-venous EC and aerocytes are present in mice and identified endothelial marker genes conserved in humans and mice. Ligand-Receptor connectome analysis revealed important homeostatic crosstalk of EC with other lung resident cell types. Our manuscript is accompanied by an online data mining tool ( www.LungEndothelialCellAtlas.com ). Conclusion Our integrated analysis provides the comprehensive and well-crafted reference atlas of lung endothelial cells in the normal lung and confirms and describes in detail previously unrecognized endothelial populations across a large number of humans and mice.

Age is a major risk factor for lung disease. To understand the mechanisms underlying this association, we characterized the changing cellular, genomic, transcriptional, and epigenetic landscape of lung aging using bulk and single-cell RNAseq (scRNAseq) data. Our analysis revealed age-associated gene networks that reflected hallmarks of aging, including mitochondrial dysfunction, inflammation, and cellular senescence. Cell type deconvolution revealed age-associated changes in the cellular composition of the lung: decreased alveolar epithelial cells and increased fibroblasts and endothelial cells. In the alveolar microenvironment, aging is characterized by decreased AT2B cells and reduced surfactant production, a finding that was validated by scRNAseq and IHC. We showed that a previously reported senescence signature, SenMayo, captures cells expressing canonical senescence markers. SenMayo signature also identified cell-type specific senescence-associated co-expression modules that have distinct molecular functions, including ECM regulation, cell signaling, and damage response pathways. Analysis of somatic mutations showed that burden was highest in lymphocytes and endothelial cells and was associated with high expression of senescence signature. Finally, aging and senescence gene expression modules were associated with differentially methylated regions, with inflammatory markers such as IL1B, IL6R, and TNF being significantly regulated with age. Our findings provide new insights into the mechanisms underlying lung aging and may have implications for the development of interventions to prevent or treat age-related lung diseases.

ABSTRACT Introduction More than 300,000 patients are placed on mechanical ventilation in the ICU annually in the United States. Many of these patients will require hyperoxia (>70% oxygen) to prevent tissue hypoxia. We have previously shown that the tyrosine kinase receptor epidermal growth factor receptor (EGFR) regulates alveolar epithelial apoptosis in hyperoxia. Mice with reduced total EGFR activity (EGFR Wa5/+ mice) show improved survival and reduced markers of ALI compared with WT in hyperoxia. How EGFR regulates additional cell death pathways in hyperoxia remains to be explored. Methods We tested the hypothesis that EGFR regulates the molecule coiled-coil moesin-like BCL2-interacting protein (Beclin-1 [BCN1]), which is known to induce autophagy, in hyperoxia. Effects of 100% oxygen were studied in EGFR Wa5/+ mice and wildtype (WT) littermates. Mice were exposed to 100% oxygen for 24, 48, and 72 hours and compared with normoxia controls. Lungs were analyzed for BCN1 via Western blot (WB), RT-qPCR, immunohistochemistry (IHC), and flow cytometry. Whole-lung and cell-specific analyses were completed. The specific BCN1 phosphorylation site (p-BCN1), serine residue 91 and 94 (Ser91, −94) for mouse (Ser93, −96 for human), that regulates autophagy was examined. Results In WT mice, hyperoxia induced increased whole-lung BCN1 compared with normoxia via WB and RT-qPCR. Whole-lung and epithelial-specific p-BCN1 was increased compared with normoxia via IHC and flow cytometry. Hyperoxia led to increased autophagy via WB and RT-qPCR. EGFR Wa5/+ mice showed increased BCN1 and reduced p-/total BCN1 ratios in hyperoxia compared with WT via WB. EGFR Wa5/+ mice also showed increased BCN1 via RT-qPCR and decreased epithelial-specific p-/total BCN1 ratios via flow cytometry, although this did not reach statistical significance. EGFR Wa5/+ mice showed reduced autophagy via WB compared with WT in hyperoxia. Conclusions Hyperoxia induced increased whole-lung and epithelial-specific BCN1 in hyperoxia and resulted in increased autophagy. Decreased EGFR activity, which leads to improved survival in hyperoxia, resulted in decreased whole-lung p-/total BCN1 ratios and decreased epithelial-specific p-/total BCN1 ratios in hyperoxia in vivo . Because BCN1 and autophagy can regulate cell death, EGFR regulation of p-BCN1 and autophagy is a mechanism in hyperoxia with therapeutic potential.

Adverse effects of large artery stiffening are well established in the systemic circulation; stiffening of the proximal pulmonary artery (PPA) and its sequelae are poorly understood. We combined in vivo (n = 6) with ex vivo data from cadavers (n = 8) and organ donors (n = 13), ages 18 to 89, to assess whether aging of the PPA associates with changes in distensibility, biaxial wall strain, wall thickness, vessel diameter, and wall composition. Aging exhibited significant negative associations with distensibility and cyclic biaxial strain of the PPA (p ≤ 0.05), with decreasing circumferential and axial strains of 20% and 7%, respectively, for every 10 years after 50. Distensibility associated directly with diffusion capacity of the lung (R