Abstract The European spruce bark beetle Ips typographus (L.) is a pest causing severe damage to Norway spruce-dominated forests in Europe. Microorganisms play an essential role in the species life history, including nutrition, fitness as well as in overcoming host defenses. Here, we performed high-throughput 16S rRNA metabarcoding of I. typographus across different populations in Europe. We investigated four postglacial refugial areas in Europe and focused specifically on a current bark beetle hot spot in the Dolomites where we compared populations with different epidemiological phases (outbreaking vs. non-outbreaking) and across different seasons (pre-overwintering vs. overwintering). Our results show that the bacterial community structure varied among populations from the refugial areas and geographic regions within the Dolomites. We found a significant difference in the bacterial community between pre-overwintering and overwintering individuals, highlighting a potential role of the microbiome in I. typographus overwintering but we did not find differences between epidemic and endemic populations. The genera Erwinia and Pseudoxanthomonas – previously reported for their role in nutrition and protection from conifer defense compounds – were present in every individual across all populations, suggesting that these taxa form the bacterial core community of I. typographus . Furthermore, several additional bacterial taxa occurred in all populations, but with variable frequencies within and between individuals. This study highlights a complex interaction of various bacterial taxa across different regions and ecological phases of I. typographus populations and provides new insights into the role of microorganisms in the biology of this important pest species.

ABSTRACT Hemipteran insects are well-known for their ancient associations with beneficial bacterial endosymbionts, particularly nutritional symbionts providing the host with essential nutrients such as amino acids or vitamins lacking from the host’s diet. Thereby, these primary endosymbionts enable the exploitation of nutrient-poor food sources such as plant sap or vertebrate blood. In turn, the strictly host-associated lifestyle strongly impacts the genome evolution of the endosymbionts, resulting in small and degraded genomes. Over time, even the essential nutritional functions can be compromised, leading to the complementation or replacement of an ancient endosymbiont by another, more functionally versatile, bacterium. Herein, we provide evidence for a dual primary endosymbiosis in several psyllid species. Using metagenome sequencing, we produced the complete genome sequences of both the primary endosymbiont ‘ Candidatus Carsonella ruddii’ and an as yet uncharacterized Enterobacteriaceae bacterium from four species of the genus Cacopsylla . The latter represents a new psyllid-associated endosymbiont clade for which we propose the name ‘ Candidatus Psyllophila symbiotica’. Fluorescent in situ hybridisation confirmed the co-localization of both endosymbionts in the bacteriome. The metabolic repertoire of Psyllophila is highly conserved across host species and complements the tryptophan biosynthesis pathway that is incomplete in the co-occurring Carsonella. Unlike co-primary endosymbionts in other insects, the genome of Psyllophila is almost as small as the one of Carsonella , indicating an ancient co-obligate endosymbiosis rather than a recent association to rescue a degrading primary endosymbiont. IMPORTANCE Heritable beneficial bacterial endosymbionts have been crucial for the evolutionary success of numerous insects, enabling the exploitation of nutritionally limited food sources such as vertebrate blood and plant sap. Herein, we describe a previously unknown dual endosymbiosis in the psyllid genus Cacospylla , consisting in the primary endosymbiont ‘ Candidatus Carsonella ruddii’ and a co-occurring Enterobacteriaceae bacterium for which we propose the name ‘ Candidatus Psyllophila symbiotica’. Its localization within the bacteriome and its small genome size confirm that Psyllophila is a co-primary endosymbiont widespread within the genus Cacopsylla. Despite its highly eroded genome, Psyllophila complements the tryptophan biosynthesis pathway that is incomplete in the co-occurring Carsonella. Moreover, the genome of Psyllophila is almost as small as the one of Carsonella , indicating an ancient dual endosymbiosis rather than a recent acquisition of a new symbiont. Hence, our results shed light on the dynamic interactions of psyllids and their endosymbionts over evolutionary time.

Bacteria infecting the plant phloem represent a growing threat worldwide. While these organisms often resist in vitro culture, they multiply both in plant sieve elements and hemipteran vectors. Such cross-kingdom parasitic lifestyle has emerged in diverse taxa via distinct ecological routes. In the genus Arsenophonus , the phloem pathogens 'Candidatus Arsenophonus phytopathogenicus' (Ap) and 'Ca. Phlomobacter fragariae' (Pf) have evolved from insect endosymbionts, but the genetic mechanisms underlying this transition have not been explored. To fill this gap, we obtained the genomes of both strains from insect host metagenomes. The resulting assemblies are highly similar in size and functional repertoire, rich in viral sequences, and closely resemble the genomes of several facultative endosymbiotic Arsenophonus strains of sap-sucking hemipterans. However, a phylogenomic analysis demonstrated distinct origins, as Ap belongs to the 'Triatominarum' clade whereas Pf represents a distant species. We identified a set of orthologs encoded only by Ap and Pf in the genus, including hydrolytic enzymes likely targeting plant substrates. In particular, both bacteria encode plant cell-wall degrading enzymes and cysteine peptidases related to xylellain, a papain-like peptidase from Xylella fastidiosa , for which close homologs are found in diverse proteobacteria infecting the plant vasculature. In silico predictions and expression analyses further support a role during phloem colonization for several of the shared orthologs. We conclude that the double emergence of phytopathogenicity in Arsenophonus may have been mediated by a few horizontal gene transfer events, involving genes first acquired from other proteobacteria including phytopathogens.