Extracellular vesicles (EVs) are naturally occurring nano-sized carriers that are secreted by cells and facilitate cell-to-cell communication by their unique ability to transfer biologically active cargo. Despite the pronounced increase in our understanding of EVs over the last decade, from disease pathophysiology to therapeutic drug delivery, improved molecular tools to track their therapeutic delivery are still needed. Unfortunately, the present catalogue of tools utilised for EV labelling lacks sensitivity or are not sufficiently specific. Here, we have explored the bioluminescent labelling of EVs using different luciferase enzymes tethered to CD63 to achieve a highly sensitive system for in vitro and in vivo tracking of EVs. Using tetraspanin fusions to either NanoLuc or ThermoLuc permits performing highly sensitive in vivo quantification of EVs or real-time imaging, respectively, at low cost and in a semi-high throughput manner. We find that the in vivo distribution pattern of EVs is determined by the route of injection, but that different EV subpopulations display differences in biodistribution patterns. By applying this technology for real-time non-invasive in vivo imaging of EVs, we show that their distribution to different internal organs occurs just minutes after administration.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) play a key role in many physiological and pathophysiological processes and hold great potential for therapeutic and diagnostic use. Despite significant advances within the last decade, the key issue of EV storage stability remains unresolved and under investigated. Here, we aimed to identify storage conditions stabilizing EVs and comprehensively compared the impact of various storage buffer formulations at different temperatures on EVs derived from different cellular sources for up to 2 years. EV features including concentration, diameter, surface protein profile and nucleic acid contents were assessed by complementary methods, and engineered EVs containing fluorophores or functionalized surface proteins were utilized to compare cellular uptake and ligand binding. We show that storing EVs in PBS over time leads to drastically reduced recovery particularly for pure EV samples at all temperatures tested, starting already within days. We further report that using PBS as diluent was found to result in severely reduced EV recovery rates already within minutes. Several of the tested new buffer conditions largely prevented the observed effects, the lead candidate being PBS supplemented with human albumin and trehalose (PBS‐HAT). We report that PBS‐HAT buffer facilitates clearly improved short‐term and long‐term EV preservation for samples stored at ‐80°C, stability throughout several freeze‐thaw cycles, and drastically improved EV recovery when using a diluent for EV samples for downstream applications.

Extracellular vesicles (EVs) can be functionalized to display specific protein receptors on their surface. However, surface-display technology typically labels only a small fraction of the EV population. Here, we show that the joint display of two different therapeutically relevant protein receptors on EVs can be optimized by systematically screening EV-loading protein moieties. We used cytokine-binding domains derived from tumour necrosis factor receptor 1 (TNFR1) and interleukin-6 signal transducer (IL-6ST), which can act as decoy receptors for the pro-inflammatory cytokines tumour necrosis factor alpha (TNF-α) and IL-6, respectively. We found that the genetic engineering of EV-producing cells to express oligomerized exosomal sorting domains and the N-terminal fragment of syntenin (a cytosolic adaptor of the single transmembrane domain protein syndecan) increased the display efficiency and inhibitory activity of TNFR1 and IL-6ST and facilitated their joint display on EVs. In mouse models of systemic inflammation, neuroinflammation and intestinal inflammation, EVs displaying the cytokine decoys ameliorated the disease phenotypes with higher efficacy as compared with clinically approved biopharmaceutical agents targeting the TNF-α and IL-6 pathways.

Abstract Being a key player in intercellular communications, nanoscale extracellular vesicles (EVs) offer unique opportunities for both diagnostics and therapeutics. However, their cellular origin and functional identity remain elusive due to the high heterogeneity in their molecular and physical features. Here, for the first time, multiple EV parameters involving membrane protein composition, size and mechanical properties on single small EVs (sEVs) are simultaneously studied by combined fluorescence and atomic force microscopy. Furthermore, their correlation and heterogeneity in different cellular sources are investigated. The study, performed on sEVs derived from human embryonic kidney 293, cord blood mesenchymal stromal and human acute monocytic leukemia cell lines, identifies both common and cell line‐specific sEV subpopulations bearing distinct distributions of the common tetraspanins (CD9, CD63, and CD81) and biophysical properties. Although the tetraspanin abundances of individual sEVs are independent of their sizes, the expression levels of CD9 and CD63 are strongly correlated. A sEV population co‐expressing all the three tetraspanins in relatively high abundance, however, having average diameters of <100 nm and relatively low Young moduli, is also found in all cell lines. Such a multiparametric approach is expected to provide new insights regarding EV biology and functions, potentially deciphering unsolved questions in this field.

Extracellular vesicles (EVs) are nanosized cell-derived vesicles produced by all cells, which provide a route of intercellular communication by transmitting biological cargo. While EVs offer promise as therapeutic agents, the molecular mechanisms of EV biogenesis are not yet fully elucidated, in part due to the concurrence of numerous interwoven pathways which give rise to heterogenous EV populations in vitro. The equilibrium between the EV-producing pathways is heavily influenced by factors in the extracellular environment, in such a way that can be taken advantage of to boost production of engineered EVs. In this study, a quantifiable EV-engineering approach is used to investigate how different cell media conditions alter EV production. The presence of serum, exogenous EVs, and other signaling factors in cell media alters EV production at the physical, molecular, and transcriptional levels. Further, it is demonstrated that the ceramide-dependent EV biogenesis route is the major pathway to production of engineered EVs during optimized EV-production. These findings suggest a novel understanding to the mechanisms underlying EV production in cell culture which can be applied to develop advanced EV production methods.

Extracellular vesicles (EVs) are gaining ground as next-generation drug delivery modalities. Genetic fusion of the protein of interest to a scaffold protein with high EV-sorting ability represents a robust cargo loading strategy. To address the paucity of such scaffold proteins, we leverage a simple and reliable assay that can distinguish intravesicular cargo proteins from surface- as well as non-vesicular proteins and compare the EV-sorting potential of 244 candidate proteins. We identify 24 proteins with conserved EV-sorting abilities across five types of producer cells. TSPAN2 and TSPAN3 emerge as lead candidates and outperform the well-studied CD63 scaffold. Importantly, these engineered EVs show promise as delivery vehicles in cell cultures and mice as demonstrated by efficient transfer of luminal cargo proteins as well as surface display of different functional entities. The discovery of these scaffolds provides a platform for EV-based engineering.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) are promising tools to transfer macromolecular therapeutic molecules to recipient cells, however, efficient functional intracellular protein delivery by EVs remains challenging. Here, we have developed novel and versatile systems that leverage selected molecular tools to engineer EVs for robust cytosolic protein delivery both in vitro and in vivo . These systems, termed VSV-G plus EV-sorting Domain-Intein-Cargo (VEDIC) and VSV-G-Foldon-Intein-Cargo (VFIC), exploit an engineered mini-intein (intein) protein with self-cleavage activity to link cargo to an EV-sorting domain and release it from the EV membrane inside the EV lumen. In addition, we utilize the fusogenic protein VSV-G to facilitate endosomal escape and cargo release from the endosomal system to the cytosol of recipient cells. Importantly, we demonstrate that the combination of the self-cleavage intein, fusogenic protein and EV-sorting domain are indispensable for efficient functional intracellular delivery of cargo proteins by engineered EVs. As such, nearly 100% recombination and close to 80% genome editing efficiency in reporter cells were observed by EV-transferred Cre recombinase and Cas9/sgRNA RNPs, respectively. Moreover, EV-mediated Cre delivery by VEDIC or VFIC engineered EVs resulted in significant in vivo recombination in Cre-LoxP R26-LSL-tdTomato reporter mice following both local and systemic injections. Finally, we applied these systems for improved treatment of LPS-induced systemic inflammation by delivering a super-repressor of NF-ĸB activity. Altogether, this study describes a platform by which EVs can be utilized as a vehicle for the efficient intracellular delivery of macromolecular therapeutics for treatments of disease. Graphic summary: Development of VEDIC and VFIC systems for high-efficiency intracellular protein delivery in vitro and in vivo Intein in tripartite fusion protein (EV-sorting Domain-Intein-Cargo) performs C-terminal cleavage during the process of EV-biogenesis, resulting in enriched free cargo proteins inside of vesicles. Together with fusogenic protein, VSV-G, these engineered EVs achieve high-efficiency intracellular delivery of cargo protein (Cre and super repressor of NF-ĸB) or protein complex (Cas9/sgRNA RNPs) both in reporter cells and in mice models.

Abstract Haematopoiesis dysregulation with the presence of immature myeloid and erythroid immunosuppressive cells are key characteristics of the immune escape phase of tumour development. Here, the role of in vitro generated B16F10 tumour cell‐derived extracellular vesicles (tEVs) as indirect cellular communicators, participating in tumour‐induced dysregulation of haematopoiesis, was explored. The isolated tEVs displayed features of small EVs with a size range of 100–200 nm, expressed the common EV markers CD63, CD9, and Alix, and had a spherical shape with a lipid bilayer membrane. Proteomic profiling revealed significant levels of angiogenic factors, particularly vascular endothelial growth factor (VEGF), osteopontin, and tissue factor, associated with the tEVs. Systemic administration of these tEVs in syngeneic mice induced splenomegaly and disrupted haematopoiesis, leading to extramedullary haematopoiesis, expansion of splenic immature erythroid progenitors, reduced bone marrow cellularity, medullary expansion of granulocytic myeloid suppressor cells, and the development of anaemia. These effects closely mirrored those observed in tumour‐bearing mice and were not seen after heat inactivating the tEVs. In vitro studies demonstrated that tEVs independently induced the expansion of bone marrow granulocytic myeloid suppressor cells and B cells while reducing the frequency of cells in the erythropoietic lineage. These effects of tEVs were significantly abrogated by the blockade of VEGF or heat inactivation. Our findings underscore the important role of tEVs in dysregulating haematopoiesis during the immune escape phase of cancer immunoediting, suggesting their potential as targets for addressing immune evasion and reinstating normal hematopoietic processes.

Abstract Being a key player in intercellular communications, nanoscale extracellular vesicles (EVs) offer unique opportunities for both diagnostics and therapeutics. However, their cellular origin and functional identity remain elusive due to the high heterogeneity in their molecular and physical features. Here, for the first time, multiple EV parameters involving membrane protein composition, size and mechanical properties on single small EVs (sEVs) are simultaneously studied by combined fluorescence and atomic force microscopy. Furthermore, their correlation and heterogeneity in different cellular sources are investigated. The study, performed on sEVs derived from Human Embryonic Kidney 293, Cord Blood Mesenchymal Stromal and Human Acute Monocytic Leukemia cell lines, identifies both common and cell line-specific sEV subpopulations bearing distinct distributions of the common tetraspanins (CD9, CD63 and CD81) and biophysical properties. Although the tetraspanin abundances of individual sEVs are independent of their sizes, the expression levels of CD9 and CD63 are strongly correlated. A sEV population co-expressing all the three tetraspanins in relatively high abundance, however, having on average diameters <100 nm and relatively low Young moduli, is also found in all cell lines. Such a multiparametric approach is expected to provide new insights regarding EV biology and functions, potentially deciphering unsolved questions in this field.

Extracellular vesicles (EVs) function as natural delivery vectors and mediators of biological signals across tissues. Here, by leveraging these functionalities, we show that EVs decorated with an antibody-binding moiety specific for the fragment crystallizable (Fc) domain can be used as a modular delivery system for targeted cancer therapy. The Fc-EVs can be decorated with different types of immunoglobulin G antibody and thus be targeted to virtually any tissue of interest. Following optimization of the engineered EVs by screening Fc-binding and EV-sorting moieties, we show the targeting of EVs to cancer cells displaying the human epidermal receptor 2 or the programmed-death ligand 1, as well as lower tumour burden and extended survival of mice with subcutaneous melanoma tumours when systemically injected with EVs displaying an antibody for the programmed-death ligand 1 and loaded with the chemotherapeutic doxorubicin. EVs with Fc-binding domains may be adapted to display other Fc-fused proteins, bispecific antibodies and antibody-drug conjugates.