Many cell division-related proteins are located at specific positions in the bacterial cell, and this organized distribution of proteins requires energy. Here, we report that the proton motive force, or more specifically the (trans)membrane potential, is directly involved in protein localization. It emerged that the membrane potential modulates the distribution of several conserved cell division proteins such as MinD, FtsA, and the bacterial cytoskeletal protein MreB. We show for MinD that this is based on the membrane potential stimulated binding of its C-terminal amphipathic helix. This function of the membrane potential has implications for how these morphogenetic proteins work and provide an explanation for the effects observed with certain antimicrobial compounds.

Daptomycin is a highly efficient last-resort antibiotic that targets the bacterial cell membrane. Despite its clinical importance, the exact mechanism by which daptomycin kills bacteria is not fully understood. Different experiments have led to different models, including (i) blockage of cell wall synthesis, (ii) membrane pore formation, and (iii) the generation of altered membrane curvature leading to aberrant recruitment of proteins. To determine which model is correct, we carried out a comprehensive mode-of-action study using the model organism Bacillus subtilis and different assays, including proteomics, ionomics, and fluorescence light microscopy. We found that daptomycin causes a gradual decrease in membrane potential but does not form discrete membrane pores. Although we found no evidence for altered membrane curvature, we confirmed that daptomycin inhibits cell wall synthesis. Interestingly, using different fluorescent lipid probes, we showed that binding of daptomycin led to a drastic rearrangement of fluid lipid domains, affecting overall membrane fluidity. Importantly, these changes resulted in the rapid detachment of the membrane-associated lipid II synthase MurG and the phospholipid synthase PlsX. Both proteins preferentially colocalize with fluid membrane microdomains. Delocalization of these proteins presumably is a key reason why daptomycin blocks cell wall synthesis. Finally, clustering of fluid lipids by daptomycin likely causes hydrophobic mismatches between fluid and more rigid membrane areas. This mismatch can facilitate proton leakage and may explain the gradual membrane depolarization observed with daptomycin. Targeting of fluid lipid domains has not been described before for antibiotics and adds another dimension to our understanding of membrane-active antibiotics.

The bacterial cytoplasmic membrane is a major inhibitory target for antimicrobial compounds. Commonly, although not exclusively, these compounds unfold their antimicrobial activity by disrupting the essential barrier function of the cell membrane. As a consequence, membrane permeability assays are central for mode of action studies analysing membrane-targeting antimicrobial compounds. The most frequently used in vivo methods detect changes in membrane permeability by following internalization of normally membrane impermeable and relatively large fluorescent dyes. Unfortunately, these assays are not sensitive to changes in membrane ion permeability which are sufficient to inhibit and kill bacteria by membrane depolarization. In this manuscript, we provide experimental advice how membrane potential, and its changes triggered by membrane-targeting antimicrobials can be accurately assessed in vivo. Optimized protocols are provided for both qualitative and quantitative kinetic measurements of membrane potential. At last, single cell analyses using voltage-sensitive dyes in combination with fluorescence microscopy are introduced and discussed.

The eukaryotic cortical actin cytoskeleton creates specific lipid domains, including lipid rafts, which determine the distribution of many membrane proteins. Here we show that the bacterial actin homologue MreB displays a comparable activity. MreB forms membrane-associated filaments that coordinate bacterial cell wall synthesis. We noticed that the MreB cytoskeleton influences fluorescent staining of the cytoplasmic membrane. Detailed analyses combining an array of mutants, using specific lipid staining techniques and spectroscopic methods, revealed that MreB filaments create specific membrane regions with increased fluidity (RIFs). Interference with these fluid lipid domains (RIFs) perturbs overall lipid homeostasis and affects membrane protein localization. The influence of MreB on membrane organization and fluidity may explain why the active movement of MreB stimulates membrane protein diffusion. These novel MreB activities add additional complexity to bacterial cell membrane organization and have implications for many membrane-associated processes.

Abstract All living organisms adapt their membrane lipid composition in response to changes in their environment or diet. These conserved membrane-adaptive processes have been studied extensively. However, key concepts of membrane biology linked to regulation of lipid composition including homeoviscous adaptation maintaining stable levels of membrane fluidity, and gel-fluid phase separation resulting in domain formation, heavily rely upon in vitro studies with model membranes or lipid extracts. Using the bacterial model organisms Escherichia coli and Bacillus subtilis , we now show that inadequate in vivo membrane fluidity interferes with essential complex cellular processes including cytokinesis, envelope expansion, chromosome replication/segregation and maintenance of membrane potential. Furthermore, we demonstrate that very low membrane fluidity is indeed capable of triggering large-scale lipid phase separation and protein segregation in intact, protein-crowded membranes of living cells; a process that coincides with the minimal level of fluidity capable of supporting growth. Importantly, the in vivo lipid phase separation is not associated with a breakdown of the membrane diffusion barrier function, thus explaining why the phase-separation process induced by low fluidity is biologically reversible.

ABSTRACT Under stressful conditions, bacterial RelA-SpoT Homologue (RSH) enzymes synthesise the alarmone (p)ppGpp, a nucleotide messenger. (p)ppGpp rewires bacterial transcription and metabolism to cope with stress, and at high concentrations inhibits the process of protein synthesis and bacterial growth to save and redirect resources until conditions improve. Single domain Small Alarmone Synthetases (SASs) are RSH family members that contain the (p)ppGpp synthesis (SYNTH) domain, but lack the hydrolysis (HD) domain and regulatory C-terminal domains of the long RSHs such as Rel, RelA and SpoT. We have discovered that multiple SAS subfamilies can be encoded in broadly distributed conserved bicistronic operon architectures in bacteria and bacteriophages that are reminiscent of those typically seen in toxin-antitoxin (TA) operons. We have validated five of these SASs as being toxic (toxSASs), with neutralisation by the protein products of six neighbouring antitoxin genes. The toxicity of Cellulomonas marina ToxSAS FaRel is mediated by alarmone accumulation combined with depletion of cellular ATP and GTP pools, and this is counteracted by its HD domain-containing antitoxin. Thus, the ToxSAS-antiToxSAS system is a novel TA paradigm comprising multiple different antitoxins that exemplifies how ancient nucleotide-based signalling mechanisms can be repurposed as TA modules during evolution, potentially multiple times independently.

ABSTRACT Competitive bacteria-bacteriophage interactions have resulted in the evolution of a plethora of bacterial defense systems preventing phage propagation. In recent years, computational and bioinformatic approaches have underpinned the discovery of numerous novel bacterial defense systems. Anti-phage systems are frequently encoded together in genomic loci termed defense islands. Here we report the identification and characterisation of a novel anti-phage system, which we have termed Shield, that forms part of the Pseudomonas defensive arsenal. The Shield system comprises a membrane-bound protein, ShdA, harboring an RmuC domain. Heterologous production of ShdA alone is sufficient to mediate bacterial immunity against a panel of phages. We show that ShdA homologues can degrade phage DNA in vitro and, when expressed in a heterologous host, can alter the organisation of chromosomal DNA to a nucleoid structure. Further analysis reveals that Shield can be divided into four subtypes, three of which contain additional components that in some cases can modulate the activity of ShdA and/or provide additional lines of phage defence. Collectively, our results identify a new player within the Pseudomonas bacterial immunity arsenal that displays a novel mechanism of protection, and reveals a surprising role of RmuC domains in phage defence. SIGNIFICANCE The evolutionary pressure exerted by bacteriophages has driven bacteria to acquire numerous defense systems. Recent studies have highlighted the extraordinary diversity of these systems, uncovering exciting links between bacterial and eukaryotic immunity. Here we describe a novel anti-phage system, named Shield, found within Pseudomonas species. We identify several Shield subtypes, all harboring the same core component, and describe its mode of action. The growing instance of multidrug-resistant bacterial infections urgently requires the development of alternative treatments. Phage therapy is a particularly pertinent approach to treat multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa strains causing severe lung infection in cystic fibrosis patients. A detailed understanding of bacterial immunity and phage counter-strategies is an essential step to underpin the rational design of phage therapy to fight disease.

ABSTRACT Transmembrane potential is one of the main bioenergetic parameters of bacterial cells, and is directly involved in energising key cellular processes such as transport, ATP synthesis, and motility. The most common approach to measure membrane potential levels is through use of voltage-sensitive fluorescent dyes. Such dyes either accumulate or are excluded from the cell in a voltage-dependent manner, which can be followed by means of fluorescence microscopy, flow cytometry, or fluorometry. Since the cell’s ability to maintain transmembrane potential relies upon low membrane ion conductivity, voltage-sensitive dyes are also highly sensitive reporters for the activity of membrane-targeting antibacterials. However, the presence of an additional membrane layer in Gram-negative (diderm) bacteria significantly complicates their use. In this manuscript, we provide guidance on how membrane potential and its changes can be reliably monitored in Gram-negatives using the voltage-sensitive dye DiSC 3 (5). We also discuss the confounding effects caused by the presence of the outer membrane, or by measurements performed in buffers rather than growth medium. We hope that the discussed methods and protocols provide an easily accessible basis for the use of voltage-sensitive dyes in Gram-negative organisms, and raise awareness of potential experimental pitfalls associated with their use.

ABSTRACT Proteins can diffuse micrometers in seconds, yet bacterial cells are able to maintain stable protein gradients. The best studied bacterial protein gradient is the Min system of Escherichia coli . In rod-shaped bacteria the MinCD proteins prevent formation of minicells by inhibiting FtsZ polymerization close to the cell poles. In E. coli these proteins oscillate between cell poles within a minute, resulting in an increased MinCD concentration at the poles. This oscillation is caused by the interaction between MinD and the protein MinE, which form an ATP-driven reaction-diffusion system, whereby the ATPase MinD cycles between a monomeric cytosolic and a dimeric membrane attached states. Bacillus subtilis also has MinCD, but lacks MinE. In this case MinCD form a static gradient that requires the transmembrane protein MinJ, located at cell poles and cell division sites. A recent reaction-diffusion model was successful in recreating the MinD gradient in B. subtilis , assuming that MinD cycles between cytosol and membrane, like in E. coli . Here we show that the monomeric and dimeric states of B. subtilis MinD have comparable membrane affinities, that MinD interacts with MinJ as a dimer, and that MinJ is not required for membrane localization of MinD. Based on these new findings we tested different models, using kinetic Monte Carlo simulations, and found that a difference in diffusion rate between the monomer and dimer, rather than a difference in membrane affinity, is important for B. subtilis MinCD gradient formation. IMPORTANCE Proteins can diffuse micrometers in seconds, yet bacterial cells are able to maintain stable protein gradients. One of the best studied examples is the membrane associated MinD protein gradient in Escherichia coli . This oscillating gradient requires cycling of MinD between a monomeric cytosolic and a dimeric membrane attached state. Bacillus subtilis also has a Min system, but in this case MinD forms a static gradient. Mathematical models have been successful in recreating the MinD gradient in B. subtilis , using an E. coli -like membrane attachment cycle of MinD. Here we show that, in contrast to the E. coli situation, the monomeric and dimeric state of B. subtilis MinD have comparable membrane affinities. Using this and other information, we tested Monte Carlo simulations and found that a difference in diffusion rate between MinD monomer and dimer, rather than a difference in membrane affinity, is important for MinD gradient formation in B. subtilis .

Toxin-antitoxins (TAs) are prokaryotic two-gene systems composed of a toxin neutralized by an antitoxin. Toxin-antitoxin-chaperone (TAC) systems additionally include a SecB-like chaperone that stabilizes the antitoxin by recognizing its chaperone addiction (ChAD) element. TACs mediate antiphage defense, but the mechanisms of viral sensing and restriction are unexplored. We identify two Escherichia coli antiphage TAC systems containing host inhibition of growth (HigBA) and CmdTA TA modules, HigBAC and CmdTAC. HigBAC is triggered through recognition of the gpV major tail protein of phage λ. Chaperone HigC recognizes gpV and ChAD via analogous aromatic molecular patterns, with gpV outcompeting ChAD to trigger toxicity. For CmdTAC, the CmdT ADP-ribosyltransferase toxin modifies mRNA to halt protein synthesis and limit phage propagation. Finally, we establish the modularity of TACs by creating a hybrid broad-spectrum antiphage system combining the CmdTA TA warhead with a HigC chaperone phage sensor. Collectively, these findings reveal the potential of TAC systems in broad-spectrum antiphage defense.